劉 賓， 李 菲， 夏 煒， 魯開化

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實驗研究

超聲空化法對脫細胞血管支架組織結構及生物力學特性影響的實驗研究

劉 賓， 李 菲， 夏 煒， 魯開化

目的 利用一定強度的超聲波，在不影響支架材料本身生物學特性的前提下，使脫細胞血管支架的膠原纖維疏松化，以利于種子細胞的黏附和長入。方法 在無菌條件下取新鮮兔股動脈, 反復凍溶+超高壓處理后，利用核酸酶進行消化，脫去殘留細胞碎片，形成脫細胞血管支架。將不同強度的超聲作用于脫細胞血管支架，通過對處理后支架材料的組織結構、生物力學特性的檢測和觀察，得出最佳的超聲處理強度。結果 超聲處理參數(shù)為強度300 W，處理間隔1 s，處理時長1 min時，脫細胞血管支架材料疏松化程度較未處理前明顯提高，而生物力學強度無明顯降低。結論 超聲空化法可以改善脫細胞血管支架材料結構致密的問題，為組織工程血管支架材料的研究提供新的思路和方法。

組織工程血管; 脫細胞血管支架; 超聲

血管支架的研究一直是血管組織工程研究領域的難點和重點。脫細胞血管基質因是一種理想的支架材料,所以在血管組織工程中得到越來越多的重視和應用[1-2]。目前組織工程學中將種子細胞種植于材料的方法有：靜態(tài)培養(yǎng)復合[3]、生物發(fā)生器內復合[4]、旋轉攪動[5]以及離心培養(yǎng)[6]等。這些細胞種植方法需要高密度的種子細胞，但仍無足夠的證據(jù)表明細胞能夠長入支架材料內部[7-8]。近年來,隨著超聲波技術的日益發(fā)展與成熟,其在新材料合成、化學反應等領域都得到了廣泛的應用。超聲波聲化學效應的主要作用之一是聲空化。在材料合成中,尤其是在納米材料以及多孔材料的制備中,超聲波空化技術有著極大的潛力[9-10]。

自2013年10月至2014年11，我們在實驗中希望通過超聲波在液體內的空化效應，利用一定強度的超聲波，在不顯著改變材料本身生物化學成分及生物力學特性的前提下，使脫細胞血管支架致密的膠原纖維疏松化，以利于種子細胞的黏附和長入。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑來源

2.0～2.5 kg的大耳白兔10只 (第四軍醫(yī)大學動物中心)。核糖核酸酶(R-Nase A)、脫氧核糖核酸酶(D-Nase Ⅰ)(美國SIGMA公司)超聲生物處理器(VIRSONIC1000，美國)

1.2 方法

1.2.1 脫細胞血管支架的制備 在麻醉、無菌條件下取出兔股動脈(20根)，去血管外膜后置入液氮罐中,-196 ℃,1 h,37 ℃水浴復溫15 min,上述凍融過程反復進行3次。將反復凍融的血管材料以D-Hank液水洗凈后放入特制塑料袋中，袋中浸滿D-Hank液。將塑料袋置入超高壓機器中，5000 atm (4 ℃)處理10 min后，無菌條件下將內層特制塑料袋中的血管取出并置入含有15 μg/ml RNase A,150μg/ml DNase Ⅰ溶液中，沖洗48 h(37 ℃, 5%CO2環(huán)境內攪拌)，然后用PBS洗凈1 d[11]。

1.2.2 超聲處理脫細胞血管支架 超聲探頭高壓滅菌處理后將脫細胞兔血管修剪為5 mm×25 mm的片狀,分6組分別置入0 ℃的PBS溶液中。將超聲探頭垂直浸入PBS液中約2 cm。使用5%、10%、20%、30%、40%,以及50%的超聲振幅，分別處理各組材料共約1 min。脈沖時間為打開1～3 s，關閉1 s。每個材料總計超聲處理時間為45～60 s。記錄超聲處理的功率百分比，每個材料所接受的累積超聲強度為50～500 W。

1.2.3 組織學觀察 將新鮮血管、脫細胞血管基質、不同強度超聲處理脫細胞血管基質置入4%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋,切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后光鏡觀察膠原形態(tài)及結構；Mason三色法觀察各材料的膠原成分構成。

1.2.4 超微結構觀察 將新鮮血管、脫細胞血管基質、不同強度超聲處理脫細胞血管基質標本經2.5%戊二醛固定, 對各組材料做掃描電鏡觀察并計算各組材料的平均孔隙率。

1.2.5 各組材料的膠原含量測定 羥脯氨酸含量測定： 新鮮血管、脫細胞血管基質、不同強度超聲處理脫細胞血管基質各取50 mg, Edwards and O′Brien測量各材質的羥脯氨酸含量。

1.2.6 力學性能的測定 將新鮮血管、脫細胞血管基質、不同強度超聲處理后的脫細胞血管基質，以INSTRUIN 1122生物力學測試系統(tǒng)(Instron Uo.美國)行單軸拉伸試驗，測定最終抗張強度和縫合強度[11]。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件的單因素分析法。兩樣本均數(shù)比較采用組間或配對比較t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察

2.1.1 大體觀察 正常兔股動脈去除外膜后呈現(xiàn)淡黃色，管腔彈性好，無塌陷；除500 W超聲處理的脫細胞支架外，其余各組強度超聲處理后的脫胞細血管材料呈現(xiàn)白色，管壁變薄，內膜完整，管壁無明顯塌陷。

2.1.2 HE染色結果 ⑴未經超聲處理脫細胞血管基質的組織學觀察：脫細胞血管的管壁膠原纖維波浪狀結構均保存完好、結構致密，支架中無細胞成分(圖1)。⑵不同強度超聲處理脫細胞血管基質的組織學觀察：超聲強度為50 W和100 W時，脫細胞血管基質的膠原結構與正常組相比無明顯變化(圖2)；超聲強度為200 W時，脫細胞血管基質的膠原結構較未處理前略疏松(圖3)；超聲強度達到300 W時，組織學觀察發(fā)現(xiàn)脫細胞血管基質的膠原結構較未處理前明顯疏松，但材料的膠原束無明顯破壞(圖4)；當超聲強度繼續(xù)增大至400 W時，材料的膠原束出現(xiàn)了明顯的破壞，血管內膜逐漸剝脫(圖5)；在超聲強度達到500 W時，脫細胞血管基質的膠原結構明顯破壞(圖6)。

2.1.3 超微結構觀察 ⑴大體結構觀察：未經超聲處理，膠原纖維波浪狀結構保存基本完好且致密(圖7)；超聲強度300 W時,血管基質的總體結構出現(xiàn)了明顯的疏松(圖8)；500 W時，血管基質的血管內膜剝脫，膠原結構明顯破壞(圖9)。⑵血管材料橫截面結構觀察：未經超聲處理，膠原結構保存完好且致密(圖10)；強度200 W時，結構較未處理前略疏松(圖11)；300 W時，結構較未處理前明顯疏松，且膠原束無明顯破壞(圖12)；強度500 W時,膠原束結構明顯破壞(圖13)。⑶血管材料表面結構觀察：未經超聲處理，膠原結構保存完好且致密(圖14)；強度200 W時，膠原結構較未處理前略疏松(圖15)；300 W時，膠原結構較未處理前明顯疏松，但膠原束無明顯破壞(圖16)；500 W時，膠原束結構明顯破壞、斷裂(圖17)；⑷血管材料表面孔隙大小觀察：經300 W超聲處理的脫細胞血管基質(圖18)，其膠原纖維結構疏松，平均孔隙大小約為(9.00±0.19) μm。

圖1 正常脫細胞血管支架(HE×100) 圖2 100 W超聲處理的脫細胞支架(HE×100) 圖3 200 W超聲處理的脫細胞支架 (HE×100) 圖4 300 W超聲處理的脫細胞支架(HE×100) 圖5 400 W超聲處理的脫細胞支架(HE×100) 圖6 500 W超聲處理的脫細胞支架(HE×100) 圖7 正常脫細胞血管支架(×50SE) 圖8 300 W超聲處理的脫細胞支架(×50SE) 圖9 500 W超聲處理的脫細胞支架(×50SE) 圖10 正常血管支架(×1.00KSE) 圖11 200 W超聲處理的脫細胞支架(×1.00KSE) 圖12 300 W超聲處理的脫細胞支架(×1.00KSE) 圖13 500 W超聲處理的脫細胞支架(×1.00KSE) 圖14 正常脫細胞血管支架(×1.00KSE) 圖15 200 W超聲處理的脫細胞支架(×1.00KSE) 圖16 300 W超聲處理的脫細胞支架(×1.00KSE) 圖17 500 W超聲處理的脫細胞支架(×1.00KSE) 圖18 300 W超聲處理后脫細胞支架材料孔隙(×5.00KSE)

Fig 1 Normal acellular vascular scaffold(HE×100). Fig 2 Acellular vascular scaffold treated with 100 watts ultrasonic (HE×100).Fig 3 Acellular vascular scaffold treated with 200 watts ultrasonic (HE×100). Fig 4 Acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (HE×100). Fig 5 Acellular vascular scaffold treated with 400 watts ultrasonic (HE×100). Fig 6 Acellular vascular scaffold treated with 500 watts ultrasonic (HE×100). Fig 7 Normal acellular vascular scaffold (×50SE). Fig 8 Acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (×50SE). Fig 9 Acellular vascular scaffold treated with 500 watts ultrasonic (×50SE). Fig 10 Normal acellular vascular scaffold (×1.00KSE). Fig 11 Acellular vascular scaffold treated with 200 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 12 Acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 13 Acellular vascular scaffold treated with 500 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 14 Normal acellular vascular scaffold (×1.00KSE). Fig 15 Acellular vascular scaffold treated with 200 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 16 Acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 17 Acellular vascular scaffold treated with 500 watts ultrasonic (×1.00KSE). Fig 18 The porosity of acellular vascular scaffold treated with 300 watts ultrasonic (×5.00KSE).

2.1.4 超聲強度的優(yōu)化 為了選擇最佳的超聲處理參數(shù)，我們將不同強度的超聲分別作用在脫細胞血管基質上約1 min，總的處理強度分別為：50、100、200、300、400和500 W，超聲脈沖處理時間為打開1～3 s，關閉1 s。通過對不同強度超聲作用于脫細胞血管基質材料組織結構變化的分析，我們發(fā)現(xiàn)：強度低于200 W的超聲對材料的組織結構無明顯影響，而當超聲強度達到300 W時，材料的膠原結構出現(xiàn)了明顯的疏松。超聲強度繼續(xù)增大，材料的膠原結構出現(xiàn)明顯破壞，血管內膜逐漸剝脫。當超聲強度大于500 W時，脫細胞血管基質的膠原結構出現(xiàn)明顯斷裂。另外，我們還觀察了不同超聲脈沖處理時間對材料組織學結構的影響，結果發(fā)現(xiàn)：處理時長為1 s的材料其膠原束分布最為均勻，為此，之后的實驗我們選擇超聲處理強度300 W，脈沖處理時長1 s，作為我們實驗中血管基質材料的超聲處理參數(shù)。

2.2 超聲處理后脫細胞血管基質的膠原含量及變性膠原含量的測定 見表1。

2.3 材料的機械力學特征 見表2。

表1 血管材料的羥脯氨酸及變性膠原含量測定結果

Tab 1 Content of hydroxyproline and degenerated collagen of the vascular material treated with 300 watts ultrasonic ±s

注：*P<0.05，強度500 W的超聲處理組與其他3組相比，羥脯 氨酸及變性膠原含量有統(tǒng)計學意義；P>0.05，強度300 W的超聲處 理組與未處理組相比，羥脯氨酸及變性膠原含量無統(tǒng)計學意義

表2 超聲處理后血管材料的生物力學性能指標測試結果

Tab 2 Results of biomechanical characteristics of the vascular material treated with 300 watts ultrasonic ±s

注*P<0.05，強度500 W的超聲處理組與其他3組相比，其最 終抗張強度及縫合強度有統(tǒng)計學意義；P>0.05，強度300 W的超聲 處理組與未處理組相比，其最終抗張強度及縫合強度無統(tǒng)計學意義

3 討論

脫細胞血管支架因其具有低免疫源性、機械性能良好等優(yōu)良特性,因此在組織工程血管研究領域有著比較廣泛的應用。然而，其也存在材料致密性高，孔隙率小，一般條件下種子細胞很難長入支架內部的缺點。因此，如何在保證支架材料機械強度的同時，使材料疏松化、多孔化一直是困擾著脫細胞血管支架材料研究領域的一個難題。

超聲在醫(yī)學中的應用一般多為影像學輔助診斷以及軟組織損傷和慢性難愈性骨折的物理治療[12-13]，關于其在生物材料制備和加工方面的應用，國內外的報道一直較少。近年來,聲空化作用引起的特殊物理和化學環(huán)境為科學家制備和加工各種組織工程生物材料提供了新的途徑[14-15],聲空化方法正成為制備具有特殊性能材料的一種新技術。

本實驗中,我們嘗試將超聲的空化效應應用在脫細胞血管支架材料多孔化、疏松化的處理過程。應用不同強度的超聲對脫細胞血管支架材料進行疏松化處理。通過對超聲處理后血管材料的組織結構及生物學特征進行分析，從而得出處理脫細胞血管基質時的有關超聲場聲學參數(shù)，及不同強度超聲處理對脫細胞血管基質材料致密性和孔隙率的影響。

良好的生物力學特性是作為組織工程血管支架材料的重要因素。通過對各種強度超聲處理前后材料的生物力學指標測定及組織結構的分析，我們發(fā)現(xiàn)：低于200 W的超聲處理強度，不會明顯降低脫細胞血管基質材料的主要生物力學指標，但其對材料膠原結構的影響也并不令人滿意，材料依然較為致密。而大于400 W的超聲處理強度雖然可以使脫細胞支架的結構更加疏松，但是，其對膠原結構的破壞同時也導致了材料主要生物力學性能指標的明顯降低。因此，在充分保證支架材料生物強度的前提下，我們選擇了低于400 W的超聲處理強度。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，超聲處理參數(shù)為：強度300 W，間隔1 s，時長1 min時，材料的疏松程度和材料的生物力學強度處于一個較均衡的水平。與未經超聲處理材料相比，強度300 W，間隔1 s，時長1 min的超聲處理可以使兔股動脈脫細胞血管基質的膠原結構明顯疏松，孔隙率增大，同時材料機械強度無明顯降低。組織工程支架材料也要有良好的結構相容性[16]，而經超聲處理脫細胞血管支架材料孔徑大小為(9.00±0.19) μm，種子細胞可以很好地長入材料，說明其基本符合組織工程血管支架材料的基本要求。

超聲處理脫細胞血管支架材料羥脯氨酸(膠原成分)及變性膠原含量測定結果表明：特定強度的超聲處理，不會對材料的膠原結構產生破壞和影響。而這一結果同時也是對于實驗中材料生物力學指標及組織結構分析結果的直接驗證。

4 結論

我們的研究表明，利用超聲聲空化效應可以達到為脫細胞基質類生物材料致密結構改性的目的，這一結論為今后解決脫細胞基質材料結構致密的問題提供了一定的思路。而在接下來的實驗中，我們將進一步通過對超聲制備的脫細胞血管支架材料的生物學、組織學相容性進行研究，探討細胞是否能夠真正的長入到經過超聲疏松化的支架材料中。

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Effect of ultrasonic cavitation on tissue structures and biomechanical characteristics of acellular vascular scaffold

LIUBin,LIFei,XIAWei,etal.

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,CentralHospitalofXianCity,Xi′an710003,China)

Objective By using a certain intensity ultrasonic to loose the collagen fibers to facilitate seed cell adhesion and ingrowths without affecting the biomechanical characteristics of the scaffold itself. Methods Vessels were isolated under sterile conditions from rabbits. After repeated freeze thawing and hyperpressure treatment, the cell debris was taken off to form the acellular vascular scaffold with nucleotidase digestion. Various intensity of ultrasonic was used to loosen the acellular scaffold. Then, tissue structures and biomechanical characteristics of the treated acellular vascular scaffold were observed to find out a optimal ultrasonic intensity.Results With the parameter of 300 watts intensity, 1 second interval and 1 minute ultrasonic treatment, we can find a unremarkably changed biomechanics compatibility and more loosen structure in comparing with normal acellular vascular scaffold.Conclusion Ultrasound cavitation method can improve the problems of the dense structure of acellular vascular scaffolds and provides us a new idea and method.

Tissue engineering blood vessels; Acellular vascular scaffold; Ultrasonic

710003 陜西 西安，西安市中心醫(yī)院 燒傷整形外科(劉 賓)；西安醫(yī)學院(李 菲)；第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 整形外科(夏 煒, 魯開化) 第一作者：劉 賓(1977-),男，陜西西安人，副主任醫(yī)師，副教授,博士,碩士生導師. 通信作者：魯開化,710032，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 整形外科,電子信箱:lukaihua@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.12.019

R318.08

A

1673-7040(2015)12-0755-05

2015-09-10)