宓 偉，趙 倩，宓思婕，練 武，石塔拉

(1.濱州醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室， 山東 煙臺(tái) 264003；2.平邑縣人民醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)室， 山東 臨沂 273300)

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研究論文

大豆異黃酮減輕反式脂肪酸誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈粥樣硬化

宓 偉1*，趙 倩1，宓思婕2，練 武1，石塔拉1

(1.濱州醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室， 山東 煙臺(tái) 264003；2.平邑縣人民醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)室， 山東 臨沂 273300)

目的觀察大豆異黃酮減輕反式脂肪酸誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用。方法 將大鼠隨機(jī)分為普通飼料組、反式脂肪酸組、大豆異黃酮組和反式脂肪酸+大豆異黃酮組，用試劑盒分別測(cè)量血中TG、HDL、LDL、IL- 6和TNF-α的含量；培養(yǎng)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，分為對(duì)照組、反式脂肪酸組和反式脂肪酸+大豆異黃酮組，Western blot法檢測(cè)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB的磷酸化，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞間黏附因子- 1(ICAM- 1)與血管細(xì)胞黏附因子(VCAM- 1)蛋白表達(dá)。結(jié)果與普通飼料組比較，反式脂肪酸組血TG、LDL、IL- 6和TNF-α明顯升高(P<0.05)，HDL顯著降低(P<0.05)。大豆異黃酮干預(yù)后，血中TG、LDL、IL- 6和TNF-α均降低(P<0.01)，HDL顯著升高(P<0.01)。大豆異黃酮能降低反式脂肪酸誘導(dǎo)的NF-κB磷酸化(P<0.01)；與對(duì)照組比較，大豆異黃酮能使反式脂肪酸誘導(dǎo)的ICAM- 1和VCAM- 1的表達(dá)降低(P<0.01)。結(jié)論大豆異黃酮可減輕反式脂肪酸誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用。

大豆異黃酮；反式脂肪酸；動(dòng)脈粥樣硬化

反式脂肪酸(trans fatty acids,TFA)是一類(lèi)含有反式非共軛雙鍵的不飽和脂肪酸的總稱(chēng)，主要來(lái)自氫化油和高溫加熱后的油脂，人體難以消化此類(lèi)不飽和脂肪酸，滯留于體內(nèi)可明顯增加患心血管疾病的概率[1]。流行病學(xué)研究顯示：TFA可改變?nèi)梭w血脂組成、干擾正常的脂質(zhì)代謝、刺激系統(tǒng)炎性反應(yīng)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，并進(jìn)一步導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展[2]。大量研究證實(shí)大豆異黃酮(soybean isoflavone，SI)對(duì)骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、癌癥和更年期綜合征具有預(yù)防效果[3]。自然界中異黃酮資源十分有限，大豆是唯一含有異黃酮且含量在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上有意義的食物資源[4]。SI能降低血膽固醇、甘油三酯(triglycerid，TG)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，同時(shí)升高高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防作用顯著。但大豆異黃酮減輕反式脂肪酸誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討大豆異黃酮干擾反式脂肪酸誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞信號(hào)通路，為臨床利用大豆異黃酮防治動(dòng)脈粥樣硬化及其新藥開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

TFA，純度>96%(上海作舟化工科技有限公司)；SI，純度>91%(四川廣瀚生物技術(shù)有限公司)；TG、HDL、LDL、IL- 6和TNF-α試劑盒(北京經(jīng)緯博恒生物科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司)；BAEC牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(廣州吉妮歐生物科技有限公司)；細(xì)胞間黏附因子- 1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM- 1)和血管細(xì)胞黏附因子(vascular cell adhesion molecule，VCAM- 1)試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)；兔抗人ICAM- 1多抗和VCAM- 1多抗、鼠抗人β-tubulin單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)80只雄性SD大鼠，體質(zhì)量190±20 g[濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(魯)2010- 0012]。

將大鼠隨機(jī)分為普通飼料對(duì)照組(normal diet)、反式脂肪酸組(TFA)、大豆異黃酮組(SI)和反式脂肪酸+大豆異黃酮組(TFA+SI)。置于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中，每籠5只，適應(yīng)動(dòng)物房環(huán)境1周。

4組飼料配制參照文獻(xiàn)[5]。

1.3 大鼠血脂生化指標(biāo)的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始大鼠斷尾取血，使用試劑盒檢測(cè)血中TG、LDL、HDL、IL- 6和TNF-α含量。

按各組飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，11周時(shí)，大鼠斷頭處死取血，檢測(cè)指標(biāo)同上。

1.4 牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

將購(gòu)買(mǎi)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮剪碎，用膠原蛋白酶處理，即可得到單個(gè)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。將處理后的細(xì)胞分別接種于含有TFA、TFA+SI和空白的DMEM生長(zhǎng)液中(均含10%小牛血清)，置于5% CO2，37 ℃，飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 Western blot檢測(cè)NF-κB磷酸化及ICAM- 1和VCAM- 1蛋白表達(dá)

大豆異黃酮濃度120 mg/L，反式脂肪酸濃度50 mg/L，方法參照文獻(xiàn)[6]，Western blot法檢測(cè)NF-κB磷酸化。

Western blot法檢測(cè)ICAM- 1和VCAM- 1蛋白表達(dá)參照文獻(xiàn)[7]，結(jié)果以目的蛋白和內(nèi)參電泳條帶的吸光度比值來(lái)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)前后血脂生化指標(biāo)比較

TFA組與普通飼料組比較，血TG和LDL水平明顯升高，而HDL顯著降低(P<0.05)。SI干預(yù)后，TG和LDL水平顯著降低，而HDL顯著升高(P<0.01)，單純SI組與普通飼料組比較，TG、LDL水平均降低，而HDL明顯升高(P<0.05)(表1)。

2.2 實(shí)驗(yàn)前后血IL- 6和TNF-α水平的比較

實(shí)驗(yàn)后TFA組與普通飼料組比較，血IL- 6和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05),實(shí)驗(yàn)后TFA+SI組與TFA組比較，血IL- 6和TNF-α水平均明顯下降(P<0.01)(表2)。

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 NF-κB活性:TFA組NF-κB活性在5、10、15、20和30 h分別為：6.54±2.13、7.65±2.89、8.14±2.56、10.25±3.12和12.47±2.36，與對(duì)照組(5.34±2.07)比較隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)(P<0.05)。SI干預(yù)后NF-κB活性在5、10、15、20和30 h分別為：4.78±2.54、2.15±1.89、1.14±1.01、0.52±0.12和0.45±0.14，與對(duì)照組(5.34±2.07)比較，活性隨時(shí)間逐漸下降(P<0.01)(圖1)。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后TG、HDL和LDL水平的比較

groupbeforetheexperimentaftertheexperimentTG(mol/L)HDL(mol/L)LDL(mol/L)TG(mol/L)HDL(mol/L)LDL(mol/L)normaldiet152±056181±089348±124 151±057 189±075 338±128TFA146±034164±075313±109 305±123? 089±069? 598±158?SI151±054174±068321±107 075±054? 314±056? 123±114?TFA+SI163±084175±074309±115 132±087?? 178±064?? 289±117??

*P<0.05 compared with normal diet group；**P<0.01 compared with TFA group.

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后血IL- 6和TNF-α水平的比較

*P<0.05 compared with normal diet group；**P<0.01 compared with TFA group.

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group

2.3.2 IACM- 1和VCAM- 1檢測(cè)結(jié)果:TFA組IACM- 1 在8、16和24 h蛋白相對(duì)含量分別為：(2.31±1.14)、(4.32±1.54)和(7.25±2.15)，較對(duì)照組(0.89±0.56)明顯升高(P<0.01)。SI干預(yù)后IACM- 1蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化(圖2)。

圖2 Western blot 法檢測(cè)各組ICAM- 1蛋白的表達(dá)Fig 2 The expressions of ICAM- 1 protein in different groups tested by Western blot

TFA組VCAM- 1 在8、16和24 h蛋白相對(duì)含量分別為：4.24±2.12、6.44±2.25和8.67±2.78，較對(duì)照組(1.85±1.16)明顯升高(P<0.01)。SI干預(yù)后VCAM- 1蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化(圖3)。

圖3 Western blot 法檢測(cè)各組VCAM- 1蛋白的表達(dá)Fig 3 The expressions of VCAM- 1 protein in different groups tested by Western blot

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化死亡人數(shù)占全國(guó)總死亡人數(shù)的30%，且發(fā)病有年輕化趨勢(shì)[8]。大量研究已證明，反式脂肪酸在體內(nèi)蓄積，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，導(dǎo)致炎性反應(yīng)， 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[9]。而包括動(dòng)脈

粥樣硬化在內(nèi)的一些慢性疾病的低發(fā)病率都與大豆及豆制品的膳食量有關(guān)，特別是大豆異黃酮具有潛在的減輕動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng)[10]。

NF-κB是重要的炎性反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)分子，幾乎存在于所有細(xì)胞中，廣泛參與機(jī)體防御反應(yīng)及組織損傷等過(guò)程。從本結(jié)果IL- 6、TNF-α和ICAM- 1、VCAM- 1的變化，可初步推斷反式脂肪酸致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制和大豆異黃酮的保護(hù)作用：反式脂肪酸集聚人體不消化，導(dǎo)致體內(nèi)TG和LDL升高，HDL降低，高水平的TG及LDL在內(nèi)膜某一部位累積進(jìn)行氧化和糖基化修飾，使該部位內(nèi)皮細(xì)胞受到應(yīng)激，出現(xiàn)受損。受損內(nèi)皮細(xì)胞大量釋放IL- 6及TNF-α等炎性因子。TNF-α反作用于內(nèi)皮細(xì)胞上的TNF-α受體，與其結(jié)合，激活了細(xì)胞內(nèi)的IκB激酶。后者作用于無(wú)活性的復(fù)合物IκB-NFκB，使其發(fā)生磷酸化，釋放出有活性的NF-κB。NF-κB進(jìn)而作用于細(xì)胞系，使受損內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)ICAM- 1和VCAM- 1。在ICAM- 1和VCAM- 1介導(dǎo)下，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板黏附并集聚于受損部位，進(jìn)而形成斑塊，從而引發(fā)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。而大豆異黃酮可使體內(nèi)的TG及LDL降低，HDL升高，從源頭上制止了TG及LDL對(duì)血管的損害。大豆異黃酮還可降低血中IL- 6及TNF-α水平，抑制NF-κB通路，減少細(xì)胞表面ICAM- 1及VCAM- 1的表達(dá)，在一定程度上減慢了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。因此，大豆異黃酮具有預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用，有一定的研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)表明大豆異黃酮對(duì)反式脂肪酸致動(dòng)脈損傷保護(hù)機(jī)制與細(xì)胞通路有關(guān)，但大豆異黃酮是通過(guò)改變反式脂肪酸的結(jié)構(gòu)，還是與TNF-α進(jìn)行受體競(jìng)爭(zhēng)或是其他因素來(lái)抑制反式脂肪酸誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化確切機(jī)制仍不清楚，尚待進(jìn)一步的研究。

[1] Santos Bruno dos, Estadella Debora, Losinskas Hachul Ana Cláudia,etal. Effects of a diet enriched with polyunsaturated,saturated,or trans fatty acids on cytokine content in the liver,white adipose tissue,and skeletal muscle of adult mice [J]. Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation, 2013,21:1- 10.

[2] Maitan-Alfenas Gabriela P, Lage Lorena G. de A, De Almeida Maíra N,etal. Hydrolysis of soybean isoflavones by Debaryomyces hansenii UFV- 1 immobilised cells and free β-glucosidase [J]. Food Chemistry,2014, 146: 429- 436.

[3] Li Gang, Jiang Yang, Fan Xin-jiong,etal. Molecular cloning and characterization of a novel β-glucosidase with high hydrolyzing ability for soybean isoflavone glycosides and glucose-tolerance from soil metagenomic library [J]. Bioresource Technology, 2012, 123: 15- 22.

[4] Chennupati Pratyusha, Seguin Philippe, Chamoun Rony,etal. Effects of high-temperature stress on soybean isoflavone concentration and expression of key genes involved in isoflavone synthesis [J]. American Chemical Society, 2012, 60: 12421- 12427.

[5] Takeuchi Hiroyuki, Kutsuwada Taiki, Shirokawa Yutaka,etal. Supplementation with 1% energy trans fatty acids had little effect on serum cholesterol levels in healthy young japanese women [J]. Biosci.Biotechnol.Biochem, 2013, 77: 1219- 1222.

[6] 徐艷杰，程曉曙. 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇代謝與動(dòng)脈粥樣硬化[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013, 33: 235- 238.

[7] Ismailov Rovshan M. Circle of Willis atherosclerosis,Alzheimer’s disease and the dean number [J]. World Journal of Cardiology, 2013, 5: 394- 396.

[8] 彭潔，郭媛. ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因變異與冠心病的研究進(jìn)展 [J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32: 1107- 1110.

[9] 項(xiàng)榮，嚴(yán)經(jīng)緯，范亮亮，等. 動(dòng)脈粥樣硬化中炎性反應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相互作用[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，34: 253- 256.

[10] Behloul N,Wu G. Genistein: a promising therapeutic agent for obesity and diabetes treatment [J]. European Journal of Pharmacology,2013, 8: 31- 38.

新聞點(diǎn)擊

3歲飲食決定成年心臟病風(fēng)險(xiǎn)

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013-06-24報(bào)道，加拿大新近研究發(fā)現(xiàn)，不健康的飲食對(duì)人體的影響，比先前研究所認(rèn)定的時(shí)間還要早許多。年紀(jì)僅3～5歲的兒童，其有些飲食會(huì)導(dǎo)致膽固醇濃度明顯升高，進(jìn)而增加成年時(shí)期患心臟病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為保護(hù)成人心臟健康，人為介入應(yīng)更早實(shí)施。

研究人員說(shuō)，幼兒3歲的飲食或能決定成年人患心臟病的風(fēng)險(xiǎn)。幼年時(shí)期不健康的飲食習(xí)慣，致使3～5歲兒童產(chǎn)生顯著的膽固醇征兆。

加拿大圣麥克醫(yī)院(St Michael’s Hospital)的研究人員說(shuō)，這表明保護(hù)健康的干預(yù)措施可以更早進(jìn)行。

研究成員佩爾紹德(Navindra Persaud)博士說(shuō)：“幼兒時(shí)期的飲食和患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)連性。3～5歲兒童體內(nèi)血清非高密度脂蛋白膽固醇(serum non-HDL cholesterol)濃度，與家長(zhǎng)所報(bào)告的飲食行為呈正相關(guān)?！?/p>

她說(shuō)：“排除年齡、性別、出生體質(zhì)量、父母身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、妊娠期糖尿病和父母種族等因子后，幼童飲食行為和血清非高密度脂蛋白膽固醇濃度之間的關(guān)連性持續(xù)存在?！?/p>

她表示，研究結(jié)果支持采取干預(yù)措施的論點(diǎn)，可改善學(xué)齡前孩童的飲食行為。先前的證據(jù)表明，為達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，可增強(qiáng)幼兒需求的回應(yīng)式喂食(Responsive feeding)，也就是說(shuō)提供合適的健康食物，以及根據(jù)兒童行為的內(nèi)在暗示(internal cues)，以決定確切喂食的時(shí)機(jī)、飲食快慢及孩童的攝取量。

Soybean isoflavone attenuates trans fatty acids-induced atherosclerosis in rats

MI Wei1*, ZHAO Qian1, MI Si-jie2, LIAN Wu1, SHI Ta-la1

(1.Dept. of Nutrition and Food Hygiene,College of Public Health and Management, Binzhou Medical University, Yantai 264003; 2.Intensive Care Unit,Pingyi People’s Hospital, Linyi 273300, China)

Objective To observe the effects of soybean isoflavone in attenuating trans fatty acids-induced atherosclerosis in rats.Methods The rats were randomly divided into normal diet group、trans fatty acids group、soybean isoflavone group and trans fatty acids+soybean isoflavone group. Research kit was used to test the amounts of TG,HDL,LDL and IL- 6,TNF-α in rats’ blood.Bovine aortic endothelial cells were cultured and divided into control group,trans fatty acids group and trans fatty acids group+soybean isoflavone group.Western blot was performed to test the NF-κB phosphorylation,as well as to determine ICAM- 1 and VCAM- 1 protein contents in bovine aortic endothelial cells.Results Compared with normal diet group,the amounts of TG,LDL,IL- 6,TNF-α increased evidently(P<0.05), whereas the amounts of HDL decreased evidently (P<0.05) in the rats’blood of trans fatty acids group.After the soybean isoflavone intervened,the amounts of TG,LDL,IL- 6,TNF-α all decreased(P<0.01), meanwhile the amounts of HDL increased significantly(P<0.01). Soybean isoflavone inhibited NF-κB phosphorylation induced by trans fatty acids(P<0.01). The high expression of ICAM- 1 and VCAM- 1 induced by trans fatty acids was decreased by soybean isoflavone when comparing with those in the control group(P<0.01). Conclusions Soybean isoflavone has a role in attenuating trans fatty acids trans fatty acids-induced atherosclerosis in rats.

soybean isoflavone; trans fatty acids; atherosclerosis

2014- 05- 26

2014- 07- 18

國(guó)家自然科學(xué)基金(81302423)；濱州醫(yī)學(xué)院科技計(jì)劃(BY2013KJ86)

1001-6325(2015)01-0007-05

R331.1

A

*通信作者(corresponding author)：miweinew@163.com