楊小青等

[摘要] 目的 比較不同提取方法蓮子心總生物堿的抗氧化活性，并以此為指標評價提取工藝。 方法 采用回流提取、超聲提取、浸漬提取法提取蓮子心中總生物堿，并比較3種提取物的體外抗氧化活性。 結果 總生物堿提取率：回流提取[（1.03±0.01）%]>超聲提取[（0.92±0.01）%]>浸漬提取法[（0.89±0.02）%]；主要成分總生物堿含量：超聲提取法>回流提取法>浸漬提取法，1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、羥基（·OH）自由基清除活性：回流提取>超聲提取>浸漬提取法，超氧陰離子活性：超聲提取法>回流提取法>浸漬提取法。 結論 回流提取法具有最高的提取率，以及強抗氧化活性，為最佳提取方法。

[關鍵詞] 蓮子心；總生物堿；提取方法；抗氧化

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0100-05

蓮子心是睡蓮科蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）的成熟種仁。根據國內外文獻報道可知，其在我國已具有兩千多年的栽種歷史，尤其在湖南、湖北、江蘇、福建、浙江等地被廣泛種植[1]。在日常生活中，蓮子心可作為茶飲料，具有清心火、止遺精之功效[2]，同時也被用作觀賞植物。自1962年研究者首次從蓮中分離出生物堿，由于其廣泛的藥理活性[3-5]，如抗HIV、抗高血脂、抗血小板聚集、降血壓、抗氧化、抗菌、抗肥胖、抗糖尿病以及抑制黑色素生成活性，蓮子心生物堿受到眾多研究者青睞。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的不斷加快，環(huán)境污染、放射線輻射等外界因素導致人體內產生大量自由基。研究證實，機體衰老、癌癥等重大疾病的產生都與體內產生的過量自由基相關[6]。而目前市場上多采用化學合成的抗氧化劑對人體具有較強的毒副作用[7]，因此，著手尋找一種天然抗氧化劑不僅可以解決過氧化對機體產生的危害，還能減少抗氧化劑自身對人體的毒副作用。本研究采用熱回流、超聲以及冷浸3種不同提取方法得到蓮子心總生物堿，在比較提取率的基礎上，比較3種不同方法得到的提取物體外抗氧化活性的能力，兩者結合作為評價指標優(yōu)選最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 主要實驗儀器

SK5200H型超聲波清洗器（鄭州長城科工貿有限公司）， UV-1800型紫外可見分光光度計（日本島津）， RE52CS型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），精密恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠），XW-80A型漩渦混合器（上?？茖С晝x器有限公司）， YXJ-1型高速離心機（深圳天南海北實業(yè)有限公司）。

1.2 主要化學試劑

丁羥甲苯（BHT，含量為99.0%），硫代巴比妥酸（TBA），ABTS[2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基]，DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基自由基），福林酚試劑（Folin-Ciocalteu's reagent），購于Sigma公司；過硫酸鉀，30%雙氧水，三氯甲烷，鐵氰化鉀，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl），氯化亞鐵，焦性沒食子酸，三氯乙酸（TCA），2-脫氧核糖，抗壞血酸（VC，含量為99.7%），乙二胺四乙酸二鈉，購于國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸對照品，購于中國藥品生物制品檢定所，含量為89.9%。

1.3植物材料

蓮子心，購于湖北天濟中藥飲片有限公司，產地為湖北洪湖，生產批號：20140101。

1.4 方法

1.4.1 蓮子心中總生物堿的提取

蓮子心磨成粗粉，過400目篩，真空干燥，分別采用回流提取法、超聲提取法、浸漬提取法進行提取。

1.4.1.1 回流提取法 稱取蓮子心粗粉100 g，置于1000 mL圓底燒瓶中加入70%乙醇（固液比1∶3），回流3次，每次1 h，趁熱過濾合并濾液，減壓旋轉蒸發(fā)回收乙醇，浸膏溶液加1%鹽酸調至pH 1～2，過濾，濾液用1%氨水調至pH 9～10，用等體積氯仿萃取2次，分液合并氯仿層，用無水硫酸鈉脫水，過濾，減壓旋轉蒸發(fā)回收氯仿得浸膏，用1%鹽酸溶解后轉移到燒杯中，再用1%氨水調至pH 9～10析出沉淀，加水至300 mL左右靜置，用砂芯漏斗過濾得沉淀，冷凍干燥得蓮心總堿粉末。

1.4.1.2 超聲提取法 稱取蓮子心粗粉100 g，置于1000 mL燒杯中加入70%乙醇（固液比1∶3），封口超聲提取3次，每次45min，過濾之后合并濾液，余下步驟及條件均同回流提取法。

1.4.1.3 浸漬提取法 稱取蓮子心粗粉100 g，置于1000 mL燒杯中加入70%乙醇（固液比1∶3），封口浸漬3次，每次8 h，過濾合并濾液，余下步驟同上。

1.4.2 蓮子心不同提取方法所得提取液中總生物堿含量測定

精密稱取蓮心堿高氯酸鹽對照品5 mg，無水乙醇溶解，冷卻至室溫，并定容至25 mL，振蕩搖勻，得濃度為200 μg/mL的蓮心堿高氯酸鹽對照品標準溶液。精密吸取上述標準溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分別置于7支10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，振蕩搖勻。靜置10 min后于282 nm處測量吸光度，用無水乙醇作為空白對照，以蓮心堿高氯酸鹽對照品的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，計算線性回歸方程。

準確稱取“1.4.1”中干燥粉末各10 mg，置于250 mL容量瓶中，無水乙醇溶解，并定容到刻度線，按上述實驗步驟測定吸光度，每種提取液平行測三組，根據蓮心堿高氯酸鹽對照品標準溶液濃度與吸光度標準曲線回歸方程計算各提取液中總生物堿含量（%）。

1.4.3 蓮子心不同提取方法所得提取液中總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu比色法[8]測定蓮子心提取物中總酚的含量。精密稱取沒食子酸11.12 mg，加水溶解并定容至25 mL，得濃度為0.4 mg/mL的對照品標準溶液。精密吸取對照品標準溶液50、100、200、300、400、500、600 μL于25 mL容量瓶中，加蒸餾水6 mL，福林酚試劑0.5 mL，在0.5～8 min內加入1.5 mL 20%Na2CO3，充分混勻后，加水定容至刻度，在30℃下避光反應30 min，以6.0 mL蒸餾水代替對照品標準液為空白對照，于波長760 nm測定吸光度，繪制標準曲線。

樣品總酚含量測定：精密稱取“1.4.1”中各干燥粉末20 mg配制成400 μg/mL溶液，吸取200 μL樣品于25 mL棕色瓶中，按上述方法測定吸光值，代入公式得沒食子酸當量。

1.4.4 體外抗氧化活性檢測

1.4.4.1 DPPH自由基清除測試 一定濃度范圍的蓮子心乙醇提取物0.3 mL分別加入2.7 mL的0.2 mmol/L DPPH（用無水乙醇溶解），渦旋混勻后，將配好的樣品避光靜置1 h后在517 nm處測其吸光度。同樣的方法以1 mL無水乙醇代替提取物作為空白對照，同樣濃度范圍的BHT、VC作為陽性對照[8]。

DPPH清除率（%）=[（AⅠ-As）/AⅠ]×100%

其中，AⅠ表示空白對照DPPH的吸光度，As表示待測樣品DPPH吸光度。

1.4.4.2 ABTS自由基清除試驗 7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L的K2S2O8以9∶1（V/V）比例混合，室溫下靜置16 h，使用前稀釋8倍作為ABTS儲備液。一系列濃度范圍的蓮子心乙醇提取物（1.0 mL）中分別加入2.5 mL ABTS儲備液，混勻后避光反應20 min并于734 nm波長處測定吸光值。以1 mL蒸餾水加ABTS待用混合液作為空白對照，VC、BHT作為陽性對照[9]。

ABTS清除率（%）=[（AⅠ-As）/AⅠ]×100%

其中，AⅠ表示空白對照ABTS的吸光度，As表示待測樣品ABTS吸光度。

1.4.4.3 羥基自由基清除 反應體系中分別加入10 mmol/L的2-脫氧核糖400 μL、FeCl3·6H2O（10 mmol/L）100 μL、EDTA-2Na（1 mmol/L）100 μL、H2O2（10 mmol/L）100 μL、樣品（10～100 μg/mL） 100 μL，再加入VC（1 mmol/L）200 μL引發(fā)反應，在37℃下反應1 h，加入1 mL 0.5%TBA的NaOH（0.025 mol/L）溶液和1 mL 30%TCA水溶液，混合物80℃水浴加熱30 min，冷卻。在532 nm處測定吸光度值（As），以0.05 mol/L PBS（pH 7.4）在反應體系中代替樣品作為空白對照測得吸光度值（AⅠ），平行測定三組，計算吸光度平均值，計算清除率，同濃度范圍的BHT作為陽性對照[10]。

羥基自由基清除率（%）=[（AⅠ-As）/AⅠ]×100%

其中，AI表示空白對照羥基自由基的吸光度，AS表示待測樣品羥基自由基的吸光度。

1.4.4.4 超氧陰離子自由基清除 1 mL 200 μg/mL待測樣品加入4.5 mL（pH 8.2，0.05 mol/L）Tris-HCl緩沖液在25℃下反應10 min，加入600 μL 0.003 mol/L鄰苯三酚（用10 mmol/L鹽酸溶解），充分反應后立即在325 nm處測定吸光度，每隔30 s測定1次吸光度，直至吸光值不再發(fā)生明顯變化，空白對照用10 mmol/L鹽酸代替樣品，BHT用作陽性對照。平行測定三組，鄰苯三酚的自氧化速率可以根據吸光度-時間曲線計算斜率，得出斜率平均值[11]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數據進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同提取方法所得蓮子心提取物提取率

回流提取、超聲提取、浸漬提取3種方法所得蓮子心乙醇提取物干燥粉末重量見表1。

2.2 蓮子心乙醇提取物中總生物堿含量

采用紫外分光光度法檢測提取液中總生物堿含量，根據總生物堿在282 nm處的特征吸收峰，得到線性回歸方程：y = 0.0139x-0.0339，R2 = 0.9999，計算出不同提取方法中所得的總生物堿濃度見表2。

表2 蓮子心不同提取方法所得提取液中總生物堿的含量（x±s）

2.3 蓮子心乙醇提取物中總酚含量

沒食子酸標準曲線回歸方程為：y = 0.099 047x+0.039 14，R2 = 0.998，計算三種提取方法中總酚含量，結果見表3。

2.4 體外抗氧化活性比較

2.4.1 DPPH自由基清除率比較

回流提取、超聲提取、浸漬提取法所得蓮子心乙醇提取物在2.70～48.65 μg/mL濃度范圍內對DPPH自由基具有良好的清除作用，且具有明顯的濃度依賴性（圖1），VC、BHT以及3種提取物對DPPH自由基的半數清除率（IC50）見表4。

對DPPH自由基的清除作用

2.4.2 ABTS自由基清除率比較

在1.43～25.70 μg/mL范圍內，3種不同提取方法所得蓮子心乙醇提取物對ABTS自由基的清除作用，與VC、BHT比較結果見圖2，IC50值見表4。

2.4.3 羥基自由基清除率比較

3種不同提取方法所得蓮子心乙醇提取物對羥基自由基的清除作用見圖3。以BHT作為陽性對照，通過對清除率分析以及曲線擬合得到IC50值見表4。

2.4.4 超氧陰離子清除率比較

采用鄰苯三酚自氧化體系比較3種不同方法得到的蓮子心提取物對超氧陰離子自氧化的抑制作用比較見圖4。BHT作為陽性對照，4種藥物作用于鄰苯三酚體系其自氧化速率見表4。

3 討論

蓮子心乙醇提取物中總生物堿具有多種成分，主要活性成分為蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿、荷葉堿等[12]。袁小紅[13]以總生物堿含量、干浸膏得率為評價指標，對水提法、水提醇沉法、半仿生提取法、半仿生提取醇沉法四種方法進行比較，提出以半仿生提取法為最佳。鐘姣姣等[14]以蓮子心為原料，用微波輔助醇提水沉法提取總生物堿，采用正交試驗優(yōu)選提取工藝，在微波功率400 W，微波時間5 min，料液比1∶30（g ∶ mL），乙醇體積分數為65%的條件下可使蓮子心總生物堿的提取率達到2.99%。

本實驗中3種提取方法所得蓮子心乙醇提取物的干燥粉末：回流提取法>超聲提取法>浸漬提取法。對其提取物的成分分析，主要成分為總生物堿，以及少量總酚，總生物堿的含量：超聲提取法>回流提取法>浸漬提取法；總酚的含量：回流提取法>超聲提取法>浸漬提取法。有文獻報道，蓮子心總生物堿遇光和熱不穩(wěn)定，可能是回流提取法中總生物堿的含量低于超聲提取法的原因[15]。

抗壞血酸、BHT是文獻報道中常見的具有很好抗氧化活性的物質[16]，在本研究中作為陽性對照。DPPH自由基的醇溶液呈紫色，在517 nm處有吸收，DPPH在反應體系中提供單電子，一旦抗氧化劑接受單電子，其吸收逐漸消失，且抗氧化性越強，褪色程度越深[17]。從圖1中可以看出，3種提取方法得到的提取物都具有一定的DPPH自由基清除能力，并且在一定濃度范圍內，具有濃度依賴性，與陽性對照相比具有顯著性差異，三種提取方法之間的IC50值有細微差異，其中回流提取得到的提取物DPPH自由基清除能力最強。在ABTS反應體系中，ABTS被氧化成藍綠色的ABTS水溶性自由基，抗氧化劑與ABTS自由基反應后使溶液褪色，特征吸光度降低，吸光度越低，表明樣品的抗氧化能力越強[18]。從圖2可以看出，在ABTS測試中，3種提取方法的提取物與VC和BHT清除ABTS自由基能力的差異顯著，但是3種提取方法之間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），3種提取方法得到提取液的半數清除率相近。本研究采用Fe3+-EDTA-抗壞血酸-過氧化氫體系產生羥基自由基，脫氧核糖受羥基自由基進攻后裂解，在酸性、加熱的條件下與硫代巴比妥酸反應生成紅色化合物，抗氧化劑的存在可阻止羥基自由基攻擊脫氧核糖[19]。根據圖3可看出，3種提取方法對羥基自由基具有不同的清除效率，并且其半數清除率均明顯高于BHT，且回流提取物具有最強的清除能力（以IC50值比較）。本研究采用經典的鄰苯三酚自氧化法評價3種不同提取方法所得總生物堿對超氧陰離子自氧化的抑制作用[20]，根據圖4，3種方法得到的提取物的自氧化速率與陽性對照BHT相近，浸漬提取物>回流提取物>超聲提取物，說明對超氧陰離子自氧化的抑制作用：浸漬提取法<回流提取法<超聲提取法。

綜上所述，本實驗采用提取率、體外抗氧化活性能力為指標綜合評價3種方法中蓮子心中的總生物堿，其可避免單因素誤差，而且根據其功效作為評價指標可以提高蓮子心乙醇提取物的利用率。回流提取法是最適合提取蓮子心中有效成分的方法，此方法不僅操作簡單、方法穩(wěn)定，而且所得提取物具有很強的DPPH、ABTS、羥基自由基、超氧陰離子清除活性，表現(xiàn)強的抗氧化活性。

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（收稿日期：2015-01-05 本文編輯：蘇 暢）