李佩瓊 章 鈞 曾 軍 王 芳 田 琪

(廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510182)

2013年3月底，中國發(fā)生人感染H7N9亞型禽流感病毒重大疫情〔1～3〕。高致病性禽流感病毒的感染會給動物和人類帶來難以承受的，甚至導(dǎo)致死亡的病癥〔4〕，特征主要表現(xiàn)為機體的免疫系統(tǒng)所介導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子風(fēng)暴以及病毒增殖所導(dǎo)致的多器官衰竭〔5〕。文獻表明〔6〕，中醫(yī)藥在抑制頑固病毒方面往往具有較好的效果。本研究評價抗戾解毒湯對于感染小鼠病毒抑制作用和保護作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所用流感病毒為 A/環(huán)境/青海/1/2008(H5N1)，所用C57BL/6小鼠為6～8周齡，購自上海源葉生物科技有限公司，奧司他韋購自上海羅氏制藥有限公司。抗戾解毒湯為本院配制，處方:佩蘭10 g、藿香10 g、姜黃10 g、白僵蠶10 g、竹茹 10 g、枳實 10 g、法半夏 10 g、青蒿 10 g，柴胡 15 g、草果 15 g、魚腥草 15 g、黃芩 15 g、大黃 5 g、炙甘草 5 g、陳皮 5 g、茯苓20 g、蟬蛻6 g。小鼠的體重及精神狀況實驗前無顯著差異，具有可比性。

1.2 小鼠的死亡保護率檢測 隨機分為實驗組，奧司他韋組和對照組各30只，小鼠麻醉(乙醚)后，使用高致病性禽流感病毒H5N1的鼠適應(yīng)株滴鼻以感染，感染后120 min內(nèi)，實驗組給予10 mg/kg的抗戾解毒湯灌胃，奧司他韋組給予5 mg/kg奧司他韋溶液腹腔注射，對照組給予PBS緩沖液灌胃，持續(xù)給藥至感染后5 d。記錄小鼠在感染病毒時及給藥后的臨床癥狀、生存情況及體重變化。

1.3 檢測肺部病毒負(fù)載水平 隨機分為實驗組、奧司他韋組和對照組各15只，按照1.2中相同方法進行麻醉，感染以及給藥，在小鼠感染后的第2、4、7天于每組隨機通過無菌操作取5只小鼠肺臟，使用液氮速凍，之后使用研缽進行研磨，再通過Easy PureTMRNA Kit試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)提取小鼠肺臟的總RNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進行。通過TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)提取RNA的反轉(zhuǎn)錄cDNA，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進行。根據(jù)文獻報道〔7〕的H5亞型禽流感病毒遺傳信息中的NP基因序列為模版比較其同源性，擴增區(qū)域選擇的是保守序列，最后使用BLAST軟件程序以及Primer 5.0引物設(shè)計的軟件進行特異性擴增引物的設(shè)計。最后通過TransStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)以及Stratagen MX3000p定量熒光PCR儀(美國安捷倫公司)進行感染小鼠的肺部病毒水平實時PCR檢測，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行one way ANOVA和χ2分析。

2 結(jié)果

2.1 3組生存保護情況對比 3組均從感染第2天開始出現(xiàn)體重的下降，并且對照組第3天有死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，持續(xù)到感染后的第9天，之后未死亡小鼠開始恢復(fù)體重，于第10天停止死亡，其死亡率為96.7%(29/30)，存活率為3.3%;奧司他韋組感染第4天開始出現(xiàn)死亡，持續(xù)至第8天，停止死亡，未死亡小鼠由第10天開始恢復(fù)體重，其死亡率為46.7%(14/30)，存活率為53.3%，實驗組感染后第5天開始出現(xiàn)死亡，持續(xù)至第8天，停止死亡，未死亡小鼠由第5天開始恢復(fù)體重，其死亡率為20.0%(6/30)，存活率為80.0%。與奧司他韋組和對照組比較，實驗組生存率顯著提高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組生存率及體重變化(±s，n=15)

表1 各組生存率及體重變化(±s，n=15)

與實驗組比較:1)P＜0.05

組別 生存率(%)體重(g)第3天 第4天 第6天 第8天 第10天 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天對照組 93.3 66.7 33.31) 13.31) 3.31) 17.8±0.1 15.3±0.1 13.1±0.3 11.5±0.61)11.6±0.11)7.3±0.4 18.6±0.1 18.8±0.3奧司他韋組 100.0 93.3 73.3 53.31) 53.31) 18.9±0.3 17.0±0.2 15.3±0.1 14.7±0.3 15.0±0.21)實驗組 100.0 100.0 86.7 80.0 80.0 18.8±0.2 17.1±0.1 1

2.2 3組肺部病毒增殖情況對比 感染2、4 d，與對照組比較，實驗組和奧司他韋組肺部流感病毒增殖明顯受抑制(P＜0.05)。實驗組效果要比奧司他韋組弱，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。感染7 d，實驗組效果比奧司他韋組略高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組與對照組均有顯著差異(P＜0.05)。見表2。

表2 各組肺部病毒增殖情況(±s，倍數(shù)，n=15)

表2 各組肺部病毒增殖情況(±s，倍數(shù)，n=15)

與對照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 第2天 第4天 第7天對照組奧司他韋組實驗組1.02±0.10 0.14±0.011)0.29±0.131)1.02±0.10 0.14±0.022)0.23±0.111)1.02±0.11 0.14±0.011)0.14±0.031)

3 討論

禽流感H5N1病毒是一種RNA病毒，負(fù)鏈，單股。它會導(dǎo)致哺乳動物、禽類及人類的嚴(yán)重疾病，全世界每年的流感、新毒株的產(chǎn)生以及季節(jié)性的流感都源自于流感病毒的變異〔8～10〕。目前，獲批有效防治流感病毒的抗病毒藥物有兩類，M2離子通道阻滯劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAI)。前者的缺點為不良反應(yīng)大，短時間內(nèi)可出現(xiàn)藥物耐藥性，并且對 B型流感病毒無效〔11〕。而NAI較昂貴，但對A、B型流感病毒均有效，不良反應(yīng)小，且可以減少藥物耐藥性的出現(xiàn)〔12〕。據(jù)報道，金剛烷胺等藥物可以用來抗禽流感H5N1病毒〔13，14〕。但是，目前在美國幾乎所有流行的甲型流感病毒株，對金剛烷胺或者奧司他韋均出現(xiàn)一定程度的耐藥性〔15〕。

本次研究提示，抗戾解毒湯的體內(nèi)抑制病毒的效果相較于奧司他韋略低，然而在整個感染周期中，抗戾解毒湯在降低小鼠死亡率作用方面較奧司他韋有一定優(yōu)勢。流感病毒在感染機體之后，首先識別機體的天然免疫體系，從而使機體天然抗病毒免疫作用被啟動，免疫細(xì)胞、趨化因子和促炎性的細(xì)胞因子被分泌，以對抗病毒感染，但是免疫細(xì)胞、趨化因子和促炎性的細(xì)胞因子的過度釋放將會導(dǎo)致“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，造成機體嚴(yán)重的免疫性病理的損傷。抗戾解毒湯的部分組成中藥都具有抑制機體炎癥反應(yīng)的作用。因此，推測抗戾解毒湯的體內(nèi)抑制促炎性的細(xì)胞因子的作用，減緩免疫應(yīng)答劇烈程度，從而在某種程度上提高H5N1病毒感染小鼠的存活率。

綜上，抗戾解毒湯對感染H5N1病毒的小鼠的病毒增殖抑制作用明顯，且保護作用強，可以作為流感病毒的備選或者輔助藥物。

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