安 娜 姜洪波 徐 磊 董獻(xiàn)紅 張瑞嶺 杜愛(ài)林

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

丁苯酞(NBP)是我國(guó)成功研制出的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類(lèi)化學(xué)新藥，是從芹菜種子中分離出的有效成分，據(jù)報(bào)道，NBP有抗驚厥、抗癲癇作用〔1〕。5-羥色胺(HT)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的單胺類(lèi)遞質(zhì)，參與人類(lèi)的行為、情緒等眾多生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。以往研究認(rèn)為5-HT是一種抑制性遞質(zhì)，對(duì)癲癇的形成具有抑制作用〔2〕，某些類(lèi)型的癲癇與大腦的5-HT能系統(tǒng)功能異常有關(guān)〔3〕。但目前對(duì)內(nèi)源性5-HT在癲癇形成過(guò)程的作用研究相對(duì)較少，也尚未有作用于5-HT能系統(tǒng)的藥物應(yīng)用于臨床。硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的毒性氣體，以往的研究多集中在其毒性作用，但目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，內(nèi)源性H2S在循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均有重要生理作用，并參與了一些疾病的病理生理過(guò)程，成為繼NO和CO之后新發(fā)現(xiàn)的第三類(lèi)氣體信號(hào)分子〔4〕。且已有研究證實(shí)外源性H2S可改善癲癇大鼠腦認(rèn)知功能障礙，內(nèi)源性H2S在熱性驚覺(jué)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用〔5〕，但這些研究均需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究通過(guò)建立大鼠戊四氮(PTZ)慢性點(diǎn)燃模型，觀察NBP對(duì)其海馬內(nèi)5-HT含量的影響及海馬內(nèi)H2S的變化，研究NBP抗癲癇作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性成年SD大鼠40只，質(zhì)量(350±20)g，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)，丁苯酞低劑量組(NL組)、丁苯酞中劑量組(NM組)、丁苯酞高劑量組(NH組)、PTZ組(P組)，每組8只，除NC組以外均建立PTZ慢性點(diǎn)燃癲癇模型。

1.1.2 儀器與試劑 Bio-Tek ELx800酶標(biāo)儀由美國(guó)Bio-Tek公司生產(chǎn);超低溫冰箱由美國(guó)Thermo Forma公司提供;高速冷凍離心機(jī)由德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn);Eclipse E200顯微鏡由日本Nikon公司提供;戊四氮由生產(chǎn);NaHS由美國(guó)ACROS公司提供;5-羥色胺系北京博奧森有限公司生產(chǎn);硫化氫測(cè)定試劑由鄭州九是公司提供;SP檢測(cè)試劑盒與DAB試劑盒系中杉金橋公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 NBP各劑量組和PTZ組大鼠均給予腹腔注射 PTZ 35 mg·kg－1·d－1。NBP 各劑量組分別給予 10、20、40 mg/kg劑量的NBP灌胃。按照Racine標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇發(fā)作的程度〔6〕。0級(jí):無(wú)驚厥;1級(jí):咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐;2級(jí):單側(cè)前肢的陣攣、抽搐;3級(jí):以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉抽搐;4級(jí):雙側(cè)前肢的陣攣、抽搐伴身體立起;5級(jí):雙側(cè)后肢強(qiáng)直、身體背曲強(qiáng)直、跌倒。連續(xù)3次達(dá)到5級(jí)的大鼠即認(rèn)為模型制作成功。各組驚厥發(fā)作的潛伏期(從給藥開(kāi)始計(jì)時(shí)，到首次發(fā)作的時(shí)間)、發(fā)作次數(shù)和強(qiáng)度以分級(jí)量表進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。每次給藥后觀察30 min，凡連續(xù)3次出現(xiàn)5級(jí)發(fā)作即判定該鼠被慢性點(diǎn)燃。

1.2.2 組織取材 各組大鼠麻醉后，立即斷頭，迅速取出腦組織，每只大鼠取一側(cè)海馬用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，用于免疫組化。另取剩下一側(cè)海馬存放于－70℃冰箱中，用于組織中H2S含量檢測(cè)。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 分光光度法間接測(cè)定海馬組織H2S的含量〔7〕，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)670 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中的H2S含量，海馬中H2S含量以單位重量的組織H2S的量(nmol/g)表示。

1.2.4 免疫組化 石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，進(jìn)行免疫組化，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察并攝片。在高倍顯微鏡(400×)下每張切片隨機(jī)攝取雙側(cè)海馬CA1區(qū)各4個(gè)視野圖片，用image-pro-plus 6.0圖像處理軟件對(duì)5-HT的陽(yáng)性表達(dá)情況進(jìn)行分析，取其平均值作為判斷5-HT陽(yáng)性的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 癲癇大鼠海馬內(nèi)H2S含量 NH組(0.358 6±0.005 14)與NC照(0.347 8±0.007 15)組相比，海馬內(nèi)H2S升高(P＜0.01);NM組(0.349 6±0.005 83)與NC組比較，海馬內(nèi)H2S升高，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

2.2 不同組PTZ點(diǎn)燃大鼠慢性癲癇模型的評(píng)價(jià)參數(shù) 與P組比較NL組癲癇發(fā)作的潛伏期、模型制作成功的時(shí)間無(wú)顯著差異。NM、NH組大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期顯著延長(zhǎng)(P＜0.01，P＜0.05)，模型制作成功的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.05，P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 光鏡觀察 NC組大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)一定量的5-HT受體陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞著色深。各組與NC組(0.972 3±0.026 8)相比，5-HT受體陽(yáng)性表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)。NM組(0.915 6±0.022 2)5-HT受體陽(yáng)性表達(dá)量最接近NC組，與P組(0.584 9±0.039 6)比較有極顯著性差異(P＜0.01)。NH組(0.790 6±0.107)與P組比較，5-HT受體陽(yáng)性表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。P組和NL組(0.829 9±0.142)海馬內(nèi)5-HT水平比較。差異顯著(P＜0.05)。P組海馬內(nèi)5-HT水平顯著低于NC組和NM、NH組(均P＜0.01)。NM、NH組海馬內(nèi)5-HT水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。光鏡下海馬細(xì)胞的變化見(jiàn)圖1。

表1 不同組PTZ點(diǎn)燃大鼠慢性癲癇模型的評(píng)價(jià)參數(shù)(±s，n=8)

表1 不同組PTZ點(diǎn)燃大鼠慢性癲癇模型的評(píng)價(jià)參數(shù)(±s，n=8)

與P組比較:1)P＜0.05;與NC組比較:2)P＜0.05;“－”表示不誘發(fā)

組別 潛伏期(s)7 d 10 d 14 d第1次達(dá)到V級(jí)的時(shí)間(d) 點(diǎn)燃時(shí)間19 d點(diǎn)燃率(%)死亡率(%)NC組 － － － － － －－100.0 0 P組 38.5±11.9 31.0±5.29 29.8±7.50 2 13.14±2.48 87.5 12.5 NL組 42.7±28.6 49.7±17.1 29.8±13.1 2 12.75±1.16 100.0 0 NM組 58.5±37.3 58.5±23.11) 53.7±28.91) 5 16.63±2.442) 100.0 0 NH組 60.5±27.8 47.5±24.4 60.7±25.21) 7 15.88±2.652)

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)光鏡下(×400)

3 討論

NBP是我國(guó)于2004年11月批準(zhǔn)上市的國(guó)家一類(lèi)新藥，為人工合成的消旋體，其左旋體存在于芹菜籽中。NBP發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用靶點(diǎn)比較廣泛，可作用于腦缺血病理的多個(gè)環(huán)節(jié)，同時(shí)還具有促進(jìn)腦血管生成〔8〕、改善記憶障礙、對(duì)腦損傷的保護(hù)作用和抗驚厥等作用，不良反應(yīng)比較小〔9〕。

選擇適當(dāng)而有價(jià)值的動(dòng)物模型是有效研究癲癇發(fā)病機(jī)制及其治療藥物的重要手段〔10〕，PTZ點(diǎn)燃癲癇發(fā)作模型能很好地模擬人類(lèi)癲癇，癲癇發(fā)作可短期或長(zhǎng)期作用于動(dòng)物的行為和腦神經(jīng)遞質(zhì)的活性。一次大劑量PTZ腹腔注射可引起較大強(qiáng)度的癲癇發(fā)作，但大鼠并不發(fā)展為慢性癲癇，只有在長(zhǎng)期反復(fù)閾下劑量導(dǎo)致較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)作后，動(dòng)物轉(zhuǎn)向具有人類(lèi)性質(zhì)的慢性EP，這一過(guò)程稱(chēng)為慢性點(diǎn)燃〔11〕。

有研究顯示，提高細(xì)胞外5-HT水平的物質(zhì)，如5-色氨酸和5-HT再攝取抑制劑，可以抑制局灶性、邊緣性和全面性發(fā)作〔12〕;耗竭腦內(nèi)5-HT水平會(huì)降低對(duì)聽(tīng)源性、化學(xué)性和電刺激誘發(fā)抽搐的發(fā)作閾值〔13〕。已有許多證據(jù)顯示5-HT具有抑制各種癲癇模型全面性驚厥發(fā)作和減輕癲癇患者發(fā)作的作用〔12〕。增加腦內(nèi)5-HT濃度可以減少最大電休克誘發(fā)發(fā)作的嚴(yán)重程度，耗竭5-HT會(huì)增加誘導(dǎo)的強(qiáng)直發(fā)作的發(fā)生率〔14〕。本研究提示NBP改善癲癇發(fā)作的機(jī)制之一可能為升高海馬內(nèi)5-HT含量，保護(hù)海馬神經(jīng)元。

H2S是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型氣體信號(hào)分子，可作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能有著重要的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，參與了一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔15，16〕。韓曉偉〔17〕的研究表明外源性H2S供體NaHS提高癲癇大鼠H2S/CBS表達(dá)水平后，可一定程度延長(zhǎng)大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期和減少大鼠自發(fā)性癲癇的發(fā)作次數(shù)，提示H2S/CBS與癲癇的發(fā)病存在相互關(guān)系。鐘聰敏〔18〕進(jìn)一步闡述了生理濃度的 H2S可以激活海馬CA1區(qū)的Cl-通道及γ-氨基丁酸(GABA)A受體介導(dǎo)的Cl-電流來(lái)降低L-谷氨酸引起的神經(jīng)元興奮作用，并且H2S以劑量依賴(lài)的方式保護(hù)細(xì)胞免受谷氨酸的氧化毒性作用。PTZ是氯離子通道的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，與GABAA受體結(jié)合，通過(guò)異構(gòu)作用于Cl-通道，阻滯了GABA受體介導(dǎo)的Cl-內(nèi)流，引起神經(jīng)細(xì)胞膜去極化、擴(kuò)散和維持癲癇發(fā)作。由以上可知生理濃度H2S的抗癲癇機(jī)制是一定程度上對(duì)抗了PTZ的作用。本研究提示NBP可能通過(guò)升高大鼠海馬內(nèi)H2S來(lái)發(fā)揮抗癲癇的作用。

綜上所述，本研究提示NBP除了用于腦缺血的治療〔8〕外對(duì)癲癇還有一定的效果，其抗癲癇的可能機(jī)制為升高了海馬內(nèi)5-HT和H2S的含量。但由于本研究是小樣本實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確的抗癲癇機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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