李克研 李美欣 張英杰 李今朝 屈寶澤 陳明紅 田 娟 李 寧

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心臟內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

研究表明，炎癥反應(yīng)是慢性心力衰竭(CHF)的發(fā)病機(jī)制之一〔1〕。白細(xì)胞介素6(IL-6)作為重要的炎癥因子，可直接或間接作用于CHF的發(fā)生和發(fā)展。IL-6基因多態(tài)性可影響其在血漿中的水平，近年來(lái)，關(guān)于IL-6基因多態(tài)性與疾病易感性的相關(guān)研究較多〔2，3〕。本研究應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)的方法，對(duì)遼寧地區(qū)漢族人群IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域-634位點(diǎn)的多態(tài)性分布進(jìn)行了研究，分析該多態(tài)性與CHF發(fā)病的相關(guān)性，以其從分子水平探討CHF發(fā)病的遺傳學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和錦州市中心醫(yī)院160例研究對(duì)象，年齡55～65歲，其中男85例，女75例，分為兩組，CHF組，男43例，女37例，健康對(duì)照組，男42例，女38例。CHF患者符合以下條件:①CHF診斷參照Framingham標(biāo)準(zhǔn)，心功能NYHA分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)、超聲心動(dòng)圖左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)＜45%;② 年齡≥18歲;③CHF病史至少≥3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn):①?lài)?yán)重肝、腎功能不全;② 嚴(yán)重的急性感染或代謝紊亂;③急性心力衰竭。健康對(duì)照組受試者經(jīng)體檢排除心血管疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、甲狀腺疾病及糖尿病。

1.2 樣本采集和DNA提取 取各組受試者前臂靜脈血5 ml，注入裝有EDTA抗凝劑的試管中備用，應(yīng)用小劑量基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 IL-6-634 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增引物序列為:正義鏈:5'-GAGACGCCTTGAAGTAACTG-3'，反義鏈:5'-AACCAAAGAT-GTTCTGAACTGA-3'(南京金斯瑞生物公司)。20 μl反應(yīng)體系包括 10 × 緩沖液(Mg2+free)2 μl，dNTP1 μl(2 mmol/L)，MgCl2(25 mmol/L)1 μl，上、下游引物各 1 μl(4 μmol/L)，基因組DNA1 μl，Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，無(wú)菌去離子水補(bǔ)充至 20 μl。循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性 94℃，5 min，94℃，30 s，60℃，50 s，72℃，1 min，共 35 個(gè)循環(huán)，最后延伸 72℃，10 min，4℃ 保存，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片段大小為180 bp。

1.4 限制性?xún)?nèi)切酶酶切多態(tài)性分析 根據(jù)文獻(xiàn)〔4〕，限制性?xún)?nèi)切酶BsrB I酶切反應(yīng):取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，BsrB I內(nèi)切酶2 U，10 × 酶切緩沖液 1 μl，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至總體積 10 μl，37℃水浴酶切過(guò)夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)直接讀取基因型結(jié)果。其中等位基因G由于存在BsrB I酶切位點(diǎn)而出現(xiàn)120 bp和60 bp 2個(gè)片段，等位基因C由于酶切位點(diǎn)消失而不能被切開(kāi)，仍為180 bp 1個(gè)片段。因此結(jié)果有3種可能的基因型，即GG基因型為2條片段，分別為120 bp和60 bp，GC基因型為3條片段，分別為180 bp、120 bp和60 bp，CC基因型為1條片段，為180 bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS11.0軟件，計(jì)算各組的IL-6-634基因型及等位基因頻率，然后經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，將雜合子GC和純合子CC數(shù)據(jù)合并，再與純合子GG數(shù)據(jù)進(jìn)行四格表資料比較，并以比值比(OR)及95%CI表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取結(jié)果及PCR擴(kuò)增結(jié)果 基因組DNA經(jīng)試劑盒提取效果較好。基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察，目的片段大小為180 bp，見(jiàn)圖 1。

2.2 IL-6-634/BsrB I基因型判定結(jié)果 IL-6-634 PCR產(chǎn)物限制性核酸內(nèi)切酶BrsB I酶切后，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，判斷各受試者的基因型，見(jiàn)圖2，圖中1號(hào)樣本，180 bp、120 bp和60 bp 3條帶，基因型為 GC;2號(hào)樣本120 bp、60 bp 2條帶，基因型為GG。3號(hào)樣本僅有180 bp 1條帶，基因型為CC。

2.3 CHF組及健康組IL-6-634/BsrB I等位基因及基因型頻率分布與比較 CHF組和健康對(duì)照組基因型均以CC型為主，GC型次之，GG型最少;等位基因以C為主。IL-6-634基因型兩組差異顯著(χ2=4.738，P＜0.05);等位基因頻率分布在兩組之間也存在顯著差異(χ2=5.391，P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 IL-6-634 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 IL-6-634基因分型結(jié)果

表1 IL-6-634/BsrB I的基因型頻率及等位基因頻率〔n(%)，n=80〕

3 討論

IL-6主要由活化的單核巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，產(chǎn)生后促進(jìn)肝細(xì)胞生成急性期反應(yīng)蛋白——C反應(yīng)蛋白(CRP)，普遍認(rèn)為CRP是冠心病發(fā)病危險(xiǎn)因素之一。IL-6作為炎癥細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化、浸潤(rùn)，并調(diào)節(jié)其他黏附分子和細(xì)胞因子的表達(dá)，從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng);同時(shí)IL-6尚可促進(jìn)心肌細(xì)胞表達(dá)黏附分子，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和心肌細(xì)胞的黏附作用，促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，從而加重心肌細(xì)胞的損傷。IL-6水平升高與冠心病的發(fā)展及嚴(yán)重程度密切相關(guān)〔5，6〕。Georges等〔7〕的研究也證實(shí)了此結(jié)論。本研究結(jié)果提示IL-6-634 G/C多態(tài)性與CHF的發(fā)病具有一定的相關(guān)性，等位基因G可能是CHF發(fā)病的易感基因，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 Biasucci LM，Santamaria M，Liuzzo G.Inflammation，atherosclerosis and acute coronary syndromes〔J〕.Minerva Cardioangiol，2002;50(5):475-86.

2 Zhang HY.The association of IL-6 and IL-6R gene polymorphisms with chronic periodontitis in a Chinese population〔J〕.Oral Dis，2014;20(1):69-75.

3 Kosugi EM.Interleukin-6-174 G/C promoter gene polymorphism in nasal polyposis and asthma〔J〕.Rhinology，2013;51(1):70-6.

4 何美霞，張明明，劉 瓊，等.白細(xì)胞介素-6基因多態(tài)性與高脂血癥的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(1):23-5.

5 Weissberg PL，Bennett MR.Atherosclerosis-an inflammatory disease〔J〕.N Engl J Med，1999;340(24):1928-9.

6 Gabriel AS，Ahnve S，Wretlind B.IL-6 and IL-1 receptor antagonist in stable angina pectoris and relation of IL-6 to clinical findings in acutemyocardial infarction〔J〕.J Intern Med，2000;248(1):61-6.

7 Georges JL，Loukaci V，Poirier O，et al.Interleukin-6 gene polymorphisms and susceptibility to myocardial infarction:the ECTIM study.Etude Cas-Temoin de I'Infarctus du Myocarde〔J〕.J Mol Med，2001;79(5-6):300-5.