潘力健 劉 磊 尚文靜 龔 輝 (復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 201508)

血管內(nèi)皮作為機體最大的內(nèi)分泌腺，可通過多種機制在凝血和動脈粥樣硬化斑塊形成過程中起重要作用。已有研究表明，內(nèi)皮功能失調(diào)是動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的始動因素之一，存在于冠心病的發(fā)生、發(fā)展中，甚至存在于冠心病發(fā)病之前〔1〕，因此，深入了解內(nèi)皮功能紊亂與冠心病之間的關(guān)系具有重要價值。瑞舒伐他汀可通過影響一氧化氮(NO)合酶(NOS)的活性，影響血管舒張因子內(nèi)皮源性NO釋放，來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能〔2〕。而非對稱二甲基精氨酸(ADMA)及其特異性水解酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)是體內(nèi)維持NOS/NO水平平衡的重要因素，本文擬分析瑞舒伐他汀是否通過DDAH/ADMA通路影響NOS/NO水平，從而來改善血管內(nèi)皮功能，進而起到治療冠心病的作用。

1 對象與方法

1.1 一般資料 2013年6月至2014年6月我院在門診體檢的健康志愿者15例，冠心病患者30例。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均符合2006年AHA/ACC冠心病和其他動脈粥樣硬化性血管疾病二級預(yù)防指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中冠脈造影冠狀動脈狹窄大于50%;②無嚴(yán)重的心肝腎等臟器疾病;③患者無糖尿病，并且體質(zhì)指數(shù)(BMI)＜30 kg/m2，低密度脂蛋白(LDL)＜2.6 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn):①有活動性肝病或肝功能異常、充血性心力衰竭、腎功能不全或出血傾向及過敏體質(zhì)者;②既往患有結(jié)核病，既往服用他汀類藥物治療，存在多種疾病并長期服用多種多類(＞2種;＞2類)藥物者。本研究符合本單位倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到批準(zhǔn)，且已得到患者與家屬的知情同意。

1.2 分組方法 冠心病患者隨機分為常規(guī)治療組和瑞舒伐他汀組，每組15例，常規(guī)治療組采取不包含瑞舒伐他汀的常規(guī)治療，瑞舒伐他汀組在常規(guī)治療組的基礎(chǔ)上運用小劑量瑞舒伐他汀5 mg口服。4 w后抽取3組靜脈血進行后續(xù)試驗。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 取各組上清，采用ELISA檢查各組血清ADMA、NOS和NO的表達水平，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.4 外周血循環(huán)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)分離及培養(yǎng) 取各組新鮮抗凝血液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)等倍稀釋，將稀釋血液緩慢加于2倍的淋巴細(xì)胞分層液上，水平離心，取細(xì)胞層重懸于PBS，洗滌離心后收集細(xì)胞于含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性纖維母細(xì)胞生長因子、類胰島素樣生長因子、表皮細(xì)胞生長因子和5%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)液中，置37℃5%CO2孵箱賠養(yǎng)。72 h后棄掉懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，第7天時收集細(xì)胞備用〔3〕。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測EPCs免疫表型 收集第7天細(xì)胞，流式洗液洗滌，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml置于流式管中。加入熒光標(biāo)記的CD146抗體，混勻后4℃標(biāo)記30 min，洗去未結(jié)合的抗體后加入300 μl預(yù)冷的洗液重懸于流式管中，流式細(xì)胞儀檢測，相關(guān)軟件分析。

1.6 DDAH活性檢測 收集第7天細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解后取上清，應(yīng)用分光光度法檢測 L-胍氨酸(L-cit)濃度來反映DDAH活性。設(shè)定健康對照組的DDAH活性為100%，其他組DDAH活性以與健康對照組的比值來表示。

1.7 DDAH mRNA測定 委托Takala公司進行DDAH引物的設(shè)計，收集第7天細(xì)胞，采用Trizol一步法提取總RNA，cDNA的制備，將提出的總RNA進行mRNA純化，在運用純化的mR-NA進行反轉(zhuǎn)錄，用反轉(zhuǎn)錄的cDNA進行熒光定量PCR，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對DDAH mRNA表達進行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ADMA、NOS和NO濃度變化 血清NO含量，常規(guī)治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯低于健康對照組，瑞舒伐他汀組含量明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05);血清NOS含量，常規(guī)治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯低于健康對照組，瑞舒伐他汀組含量明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05);血清ADMA含量，常規(guī)治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯高于健康對照組，瑞舒伐他汀組含量明顯低于常規(guī)治療組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組血清ADMA、NOS和NO含量(±s，n=15)

表1 各組血清ADMA、NOS和NO含量(±s，n=15)

與健康對照組相比:1)P＜0.05;與常規(guī)治療組相比:2)P＜0.05

組別 NO(μmol/L) NOS(μmol/L) ADMA(ng/ml)95.23±5.62 34.95±5.23 180.65±6.99常規(guī)治療組 69.21±6.011) 10.97±4.961) 260.78±6.261)瑞舒伐他汀組 76.91±5.491)2) 16.55±5.341)2)231.53±4.521)2)健康對照組

2.2 各組EPCs中CD146表達比例變化 常規(guī)治療組〔(60.59±4.63)%〕及瑞舒伐他汀組EPCs中CD146表達比例〔(68.22±5.11)%〕均明顯低于健康對照組〔(75.65±5.96)%〕，瑞舒伐他汀組比例明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05)。

2.3 各組EPCs中DDAH活性變化 健康對照組的DDAH活性為100%，常規(guī)治療組(49.24%±5.65%)及瑞舒伐他汀組DDAH活性(62.13%±3.48%)均明顯低于健康對照組，瑞舒伐他汀組活性明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05)。

2.4 各組EPCs中DDAH mRNA表達變化 常規(guī)治療組(0.60±2.34)及瑞舒伐他汀組 DDAH mRNA相對表達量(0.71±3.82)均明顯低于健康對照組(1.00)，瑞舒伐他汀組活性明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05)。

3 討論

血管內(nèi)皮是體內(nèi)重要屏障，通過多種機制參與動脈粥樣硬化斑塊形成過程。研究證實，內(nèi)皮功能紊亂與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其機制可能與以下相關(guān):①內(nèi)皮功能紊亂可導(dǎo)致生成的NO含量減少，對LDL氧化修飾的抑制度降低，LDL生成增加，從而促進了血管內(nèi)膜脂質(zhì)的沉積〔4〕;②NO可與體內(nèi)相關(guān)物質(zhì)結(jié)合提高組織型纖溶酶原激活劑的活性，并且可抑制血小板聚集，影響血管內(nèi)炎性因子的分泌和調(diào)節(jié)，破壞血管內(nèi)皮影響血管功能〔5〕;③NO含量減少，導(dǎo)致內(nèi)皮素-1分泌增加，促進了細(xì)胞的增殖和血管調(diào)節(jié)，導(dǎo)致了血管的損傷，從而促進了冠心病的產(chǎn)生;④內(nèi)皮功能紊亂可導(dǎo)致氧自由基生成增多，使血管擴張受抑制，使其抗血栓、抗黏附等能力降低，有利于冠心病的發(fā)生;⑤內(nèi)皮細(xì)胞受損，黏附因子表達增加，促進了細(xì)胞間的黏附結(jié)合，使形成脂質(zhì)斑塊的能力增強〔6〕。NO在體內(nèi)是以L-精氨酸為底物，經(jīng)NOS催化而生成，體內(nèi)的ADMA為內(nèi)源性NOS抑制物，可抑制NO的合成，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂。DDAH是ADMA的特異性水解酶，位于內(nèi)皮樣細(xì)胞中，它在調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞內(nèi)ADMA水平中起關(guān)鍵作用，多數(shù)研究人員認(rèn)為，DDAH/ADMA通路與NO的生成、分泌、降解等密切相關(guān)〔7〕。

瑞舒伐他汀在臨床上的推廣多得益于調(diào)節(jié)血脂水平(尤其是LDL)來穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化斑塊，從而改善糖尿病患者的臨床癥狀。不過近來發(fā)現(xiàn)，其具有獨立于調(diào)脂治療以外的多效性作用，如:抗炎作用，改善內(nèi)皮細(xì)胞的作用，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，抑制血栓形成的作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)分化或凋亡等作用，其中改善血管內(nèi)皮功能的作用倍受關(guān)注〔8〕。瑞舒伐他汀對血管內(nèi)皮功能影響的可能機制有:①增加NO的釋放和利用度，降低LDL生成，從而減少了脂質(zhì)的沉積;②增加LDL氧化阻力;③抑制炎性反應(yīng);④促進斑塊穩(wěn)定等〔9，10〕，但其具體機制仍未明確。

本研究提示了瑞舒伐他汀可能通過影響NO/NOS通路來發(fā)揮藥理作用。CD146是目前公認(rèn)的EPCs特異標(biāo)記分子，瑞舒伐他汀可通過調(diào)整EPCs來起到治療作用。瑞舒伐他汀可能通過影響DDAH/ADMA通路來影響內(nèi)皮功能，從而達到治療作用。然而，瑞舒伐他汀通過何種機制影響DDAH/ADMA通路，并且阻斷DDAH/ADMA通路是否可以阻斷瑞舒伐他汀的治療作用，還需要深入研究。

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