張喜庫(kù) 劉桐輝

吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院藥劑科,吉林吉林 132022

HPLC法測(cè)定磷酸奧司他韋膠囊的含量

張喜庫(kù) 劉桐輝

吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院藥劑科,吉林吉林 132022

目的建立一種測(cè)定磷酸奧司他韋膠囊含量的方法。方法采用高線液相色譜法測(cè)定磷酸奧司他韋的含量，色譜柱：Kromasil C8（250mm×4.6mm，5μm）,流動(dòng)相為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（40%氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至5.5）-甲醇-乙腈（70:20:10），檢測(cè)波長(zhǎng)為207nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL。結(jié)果磷酸奧司他韋在1～50μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9992）。平均回收率為99.8%,RSD=0.9% (n=9),穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.8%。結(jié)論此方法操作簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度高,適用于磷酸奧司他韋膠囊的含量測(cè)定。

高相液相色譜法；磷酸奧司他韋；含量測(cè)定

流行性感冒是一種急性呼吸道傳染病。它是由流感病毒感染鼻、竇、咽喉、肺、中耳等部位，引起的一種傳染性強(qiáng)、傳播速度快的疾病[1]。自2009年墨西哥爆發(fā)甲型H1N1流感以來(lái)，短短數(shù)月便席卷全球，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。其病毒基因包括豬流感、禽流感以及人流感三種基因片段。由于流感病毒變異性強(qiáng)、傳染面廣、發(fā)病率高，普通感冒藥物無(wú)法有效抑制其發(fā)展，而且容易產(chǎn)生耐藥性。

磷酸奧司他韋膠囊（oseltamivir phosphate capsules），又名達(dá)菲，是一種具有選擇性的、強(qiáng)效的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑[3]，性狀為白色至黃白色粉末。磷酸奧司他韋的活性代謝產(chǎn)物能夠有效抑制甲型、乙型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶活性，從而阻止或干擾流感病毒的復(fù)制。通過(guò)抑制被感染的細(xì)胞中病毒的釋放，減少甲型、乙型流感病毒的傳播與擴(kuò)散。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]，在體外觀察到其活性代謝產(chǎn)物對(duì)病毒神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度低至納克水平，抑制甲型、乙型流感病毒生長(zhǎng)，在體內(nèi)也觀察到其抑制流感病毒的復(fù)制和致病性。磷酸奧司他韋現(xiàn)為WHO和我國(guó)衛(wèi)生部組織推薦的抗病毒的首選藥。

目前，我國(guó)尚無(wú)測(cè)定磷酸奧司他韋含量標(biāo)準(zhǔn)方法，磷酸奧司他韋的含量測(cè)定無(wú)法做到正規(guī)化、標(biāo)準(zhǔn)化。因此，建立一種快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法已迫在眉睫。本研究結(jié)合前人經(jīng)驗(yàn)，建立一種快速、準(zhǔn)確、可靠的測(cè)定含量的方法，為完善其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 LC高效液相色譜儀；Sartorius Bp211D分析天平；JCX-400G超聲清洗器；UV759紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 試藥

磷酸奧司他韋原料藥（宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司提供）；磷酸奧司他韋膠囊（宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)022130512、022131203、0221406002）；磷酸二氫鉀（北京化學(xué)試劑公司）、甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）、乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）為色譜純；超純水；其余試劑皆為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇[6]

色譜柱：Kromasil C8（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（40%氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至5.5）-甲醇-乙腈（70∶20∶10）；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

取磷酸奧司他韋對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成1.0mg/mL的溶對(duì)照品溶液，用紫外分光光度儀在200～400nm范圍進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液在207nm處有最大吸收。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及相關(guān)參考文獻(xiàn)[6-7]，本實(shí)驗(yàn)選用207nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 溶劑的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備[7]以磷酸奧司他韋原料藥作為對(duì)照品，精密稱取，約50.0mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇10mL超聲溶解5min，加入流動(dòng)相[0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-甲醇-乙腈（70∶20∶10）]，稀釋至刻線，搖勻，濾過(guò)，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備[7]精密稱取磷酸奧司他韋樣品適量，（相當(dāng)于磷酸奧司他韋10.0mg），置于10mL容量瓶中，加入甲醇2mL超聲溶解5min，加入流動(dòng)相[0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-甲醇-乙腈（70∶20∶10）]，稀釋至刻線，搖勻，濾過(guò)，備用。

2.2.3 空白輔料溶液的制備[8]按處方比例稱取輔料，制備不含磷酸奧司他韋的空白輔料樣品。精密稱取上述空白輔料適量（按處方量相當(dāng)于磷酸奧司他韋50.0mg），置于10mL容量瓶中，加入甲醇2mL超聲溶解5min，加入流動(dòng)相[0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-甲醇-乙腈（70∶20∶10）]，稀釋至刻線，搖勻，濾過(guò)，備用。

2.3 陰性干擾試驗(yàn)[9]

取空白輔料溶液，按選定的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，空白輔料不干擾磷酸奧司他韋的含量測(cè)定。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[9-10]

取對(duì)照品、供試品（批號(hào)0221406002）溶液，按選定的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。主峰與各雜質(zhì)峰間的分離度（R）＞1.5，符合要求，理論塔板數(shù)按磷酸奧司他韋峰計(jì)應(yīng)＞2000。

2.5 線性關(guān)系的考察[10]

圖1 陰性干擾性試驗(yàn)及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)圖譜

精密吸取對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為1.009mg/mL）分別精密吸取對(duì)照品溶液1、5、10、20、30、40、50μL注入色譜儀中，記錄峰面積，并以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，見(jiàn)表1回歸方程為Y=199.97X-106.55（r=0.9992，n=7）。

結(jié)果表明，磷酸奧司他韋在1～50μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 檢測(cè)限與定量限[11]

按信噪比3∶1計(jì)算，測(cè)得磷酸奧司他韋的最低檢測(cè)限為6ng。按信噪比10∶1計(jì)算，測(cè)得磷酸奧司他韋的定量限為25ng。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)[11-12]

取批號(hào)為0221406002的磷酸奧司他韋供試品，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、24h，按選定的色譜條件依次進(jìn)樣，測(cè)得其峰面積，見(jiàn)表2。RSD=0.4%（n=6），結(jié)果表明，供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 精密度試驗(yàn)[10-12]

取批號(hào)為0221406002的磷酸奧司他韋供試品，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按選定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定6次峰面積，見(jiàn)表3。RSD=0.2%（n=6），結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)[10-12]

取同一批號(hào)（0221406002）的磷酸奧司他韋供試品，按2.3項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按選定的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，并計(jì)算其含量，見(jiàn)表4。RSD=0.8%（n=6），結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 回收率試驗(yàn)[6]

精密稱取磷酸奧司他韋原料藥8.0、10.0、12.0mg，各3份，分別置于50mL的容量瓶中，同時(shí)按處方比例加入空白輔料，加入選定的流動(dòng)相溶解并定容。另取磷酸奧司他韋10.0mg，精密稱定后置于50mL的容量瓶中，以流動(dòng)性溶解并定容，作為對(duì)照品溶液。濾過(guò)上述溶液，依次精密量取20μL進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算本品的回收率，見(jiàn)表5。結(jié)果表明，9份樣品的回收率在98.4%～101.5%，RSD=0.9%。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.11 含量測(cè)定[12]

取3種不同批號(hào)的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精按選定的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，三個(gè)批號(hào)的磷酸奧司他韋含量均在99.06%以上。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在200 ～ 400nm范圍內(nèi)，對(duì)磷酸奧司他韋進(jìn)行紫外分析，發(fā)現(xiàn)在207nm波長(zhǎng)處有最大吸收值，且空白輔料溶液在此處無(wú)吸收，測(cè)定結(jié)果適宜。

3.2 色譜柱的選擇

現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜柱的選擇，因此，試驗(yàn)中應(yīng)選用穩(wěn)定且分離度好的色譜柱。本實(shí)驗(yàn)篩選不同廠家的色譜柱：Phenomenex C8色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），Kromasil C8（250mm×4.6m，5μm），Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm），him-pack VP-ODS C18（150mm ×4.6mm，5μm），Ecosil C8（4.6mmx250mm，5μm）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)選用Kromasil C8（250mm×4.6mm，5μm）時(shí)，得到的峰形較好，可與雜質(zhì)峰完全分離，且出峰時(shí)間適宜。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本文對(duì)磷酸二氫鉀溶液（氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至5.5）-甲醇-乙腈（80∶10∶10、70∶20∶10、60∶20∶20）三種不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為磷酸二氫鉀溶液-甲醇-乙腈（70∶20∶10）進(jìn)行洗脫時(shí)，保留時(shí)間為6.5min，主峰峰型及分離度最佳，且無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

3.4 pH的影響

本文對(duì)不同pH值（3.5～7.5）的流動(dòng)相進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)溶液pH=5.5時(shí)，磷酸奧司他韋的溶解度大，且穩(wěn)定性好。出峰時(shí)間適宜，峰型對(duì)稱，對(duì)色譜柱無(wú)損害。因此，本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相pH值選擇為5.5。

3.5 柱溫的選擇

隨著柱溫升高，分析速度也加快。但柱溫過(guò)高，會(huì)造成主成分不穩(wěn)定。經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)，柱溫為30℃時(shí)，分析速度適中，出峰時(shí)間恒定。因此，本實(shí)驗(yàn)柱溫選擇30℃。

綜上所述，本方法具有快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于磷酸奧司他韋的含量測(cè)定。

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Content determination of oseltamivir phosphate capsules by HPLC

ZHANG Xiku LIU Tonghui
Department of Pharmacy,the General Hospital of CNPC in Jilin City,Jilin 132022,China

ObjectiveTo establish an method for the determination of Oseltamivir Phosphate capsules.MethodsHPLC method was adopted.The separation was performed on Kromasil C8（250mm×4.6mm,5μm）, column with mobile phase consisted of 0.05mol/L postassiam dihydrogen phosphate (adjust pH to 5.5 with 40% potassium hydroxide)- methanol- acetonitrile(70:20:10). UV detection wavelength was set at 207nm,the column temperature was maintained at 30℃,the flow rate was 1.0mL/min and the sample size was 20μL.ResultsThe line arrange of Oseltamivir Phosphate was 1-50μg,the correlation coefficient was 0.9990 and the average recovery was 99.8%(RSD=0.9%，n=9).RSDs of stability test,precision test,reproducibility test were all less than 0.8%.ConclusionThe method is simple,quick, accurate and suitable for the content determination of Oseltamivir Phosphate capsules.

HPLC; Oseltamivir phosphate; Content determination

R927.2

A

2095-0616（2015）05-51-04

2014-12-23）