劉金香　姚正穎　張衛(wèi)明等

摘要：油體是植物種子貯脂的細(xì)胞器，通過分離油體來提取脂類為研究植物脂類提供了方便快捷的方法。首次建立了能源植物續(xù)隨子種子油體的提取方法，提取了江蘇海安和河南朱集2個(gè)產(chǎn)地的續(xù)隨子種子油體，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，分別測定油體脂肪酸的組成與含量。結(jié)果表明，2個(gè)產(chǎn)地的續(xù)隨子種子油體脂肪酸都以油酸為主，含量分別為83.32%、73.99%，其中含量較多的脂肪酸還有棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸等；2種種子中的脂肪酸以油酸（82.04%、75.63%）和棕櫚酸（6.00%、11.75%）為主，相對(duì)含量差異顯著，且油酸含量與棕櫚酸含量呈負(fù)相關(guān)，即油酸含量高的種子的棕櫚酸含量較低。

關(guān)鍵詞：能源植物；油體；提??；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；脂肪酸

中圖分類號(hào)：S216.2；TQ646 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0256-03

油體是植物種子貯脂的細(xì)胞器，化學(xué)組分含量因植物種類而異，且與植物生長的環(huán)境和營養(yǎng)條件有關(guān)，一般為直徑0.5～2.0 μm的彈性球體或橢球體[1-3]。油體的主要成分為中性脂（主要為三酰甘油，簡寫為TAG）、油體蛋白和磷脂（PL），其內(nèi)部為疏水的液態(tài)TAG核心，外層是由磷脂單分子層及鑲嵌的油體蛋白形成的半單位膜，油體表面具有親水特性[4]。磷脂和蛋白通過空間位阻和靜電排斥作用賦予油體顯著的物化穩(wěn)定性（抗機(jī)械攪拌、抗凍融、抗氧化等），從而阻止油體相互融合，這一特性使得油體可用離心的方法分離純化[5-6]。大戟科植物續(xù)隨子（Euphorbia lathyris）是一種優(yōu)良能源植物，其種子油脂肪酸成分以C16、C18脂肪酸為主，且油酸（只含1個(gè)不飽和雙鍵）含量高達(dá)83%[7]，與理想柴油替代品的分子組成類似。有研究表明，理想的生物柴油替代品結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是單不飽和脂肪酸含量高、多不飽和脂肪酸含量低、飽和脂肪酸含量適中[8]，其分子式可表示為 C19H36O2。通過離心分離續(xù)隨子種子油體，從而提取脂肪酸，再通過甲酯化制備生物柴油，可降低生物柴油制備成本。然而到目前為止，還無有關(guān)續(xù)隨子油體的報(bào)道。本研究提取續(xù)隨子種子油體，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，分析了江蘇海安和河南朱集2個(gè)產(chǎn)地的續(xù)隨子種子油體脂肪酸的成分與含量，為續(xù)隨子種子油體及脂肪酸研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

將分別來源于江蘇海安和河南朱集2個(gè)產(chǎn)地的續(xù)隨子種子，于2013年10月種植于南京野生植物綜合利用研究院試驗(yàn)田中，按相同的方法進(jìn)行栽培管理，翌年7月成熟后收獲，收獲的種子即為本研究所用種子，簡稱為海安種子、朱集種子。

1.1.2 主要儀器 7820A氣相串聯(lián)5975質(zhì)譜檢測器，安捷倫科技有限公司；Hitachi 20PR-52D 高速冷凍離心機(jī)，日本日立工機(jī)株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 油體的提取

參考Katavic等的方法[9]并作適當(dāng)改動(dòng)。分別取5 g朱集種子和海安種子，在20 mL GMI（1 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、2 mmol/L DTT（雙對(duì)氯苯基三氯乙烷）、0.6 mol/L 蔗糖、0.15 mol/L Tricine-KOH，pH值7.5）中研磨成勻漿，3層紗布過濾，再加20 mL FMI（除蔗糖由0.6 mol/L換成0.4 mol/L外，其他成分與GMI相同）后，12 000 g離心20 min，上層即為粗油體層；取上層油層重懸于20 mL GMI，再加15 mL正己烷，12 000 g離心20 min；取上層油層重懸于 20 mL 的GMI中，再加15 mL FMI，12 000 g 離心20 min；最終油體層懸浮于5 mL GMI中（GMI和FMI均于4 ℃預(yù)冷）。

1.2.2 油體極性脂與中性脂的分離與提取

參考Katavic等的方法[9]并作適當(dāng)改動(dòng)。向分離得到的油體中加入等體積的石油醚，渦旋振蕩，12 000 g離心10 min；收集上層富含中性脂（即TAG）的石油醚相，重復(fù)上述石油醚萃取過程3次，將每次收集的上層混合，氮?dú)獯蹈?。剩余部分與1.5倍體積的三氯甲烷-甲醇（體積比2 ∶1）混合，振蕩，收集下層三氯甲烷相，用1 mL甲醇-水（體積比1 ∶1）清洗2次，氮?dú)獯蹈?，即得到極性脂（即PL）。將收集的油成分進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.3 脂肪酸成分的測定與分析

1.2.3.1 脂肪酸甲酯化

采用硫酸-甲醇法，對(duì)提取的油體進(jìn)行脂肪酸甲酯化，其過程如下：10 μL樣品與10 μL（即 6 μg）的十七烷酸（C17 ∶0）混合作為內(nèi)標(biāo)，移入帶塞玻璃試管中，在試管中加入1.5 mL硫酸甲醇溶液（5%硫酸+95%甲醇），充氮?dú)夂竺芊?；將試管?5 ℃下水浴1 h，冷卻，加入15 mL正己烷和1 mL水終止甲基化反應(yīng)，振蕩后于 2 500 r/min 離心10 min，收集上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?0 mL正己烷，取2 μL樣進(jìn)行GC-MS分析。將種子研磨后，采用上述方法，對(duì)種子直接甲酯化，并進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.3.2 GC-MS 檢測條件

（1）氣相色譜條件。Agilent HP-5MS （30 m ×250 μm ×0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱，程序升溫，初始柱溫120 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升溫到260 ℃保持10 min；載氣為99.999%氦氣，流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃，接口溫度230 ℃；進(jìn)樣量為2 μL，分流比30 ∶1。（2）質(zhì)譜條件。EI 離子源，離子源溫度230 ℃，MS四極桿溫度150 ℃，掃描范圍50～550 amu，溶劑延遲3.0 min。檢索標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11.L，利用峰面積歸一法計(jì)算各組分相對(duì)含量。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 種子油體的提取

由圖1可知，收獲的海安種子、朱集種子外觀基本一致，千粒質(zhì)量分別為41.394、44.102 g，二者差異不顯著（P<005）。種子中的磷脂和蛋白由于空間位阻和靜電排斥作用，賦予了油體穩(wěn)定性，主要體現(xiàn)在油體的互不相溶性，這使得油體可以用離心的方法分離。在提取油體過程中，海安種子的研磨液顏色較朱集種子的研磨液黃，而最終提取的2種種子油體顏色均為乳白色，這是油體乳化的結(jié)果?？梢?，提取時(shí)的研磨過程并沒有破壞油體的結(jié)構(gòu)，即在提取過程中，油體保持了表面親水、內(nèi)部疏水的基本特征，同時(shí)也顯示了油體顯著的穩(wěn)定性，這與其他植物種子油體的性質(zhì)相同[3，10]。

2.2 種子和油體的脂肪酸組成分析

海安種子、朱集種子經(jīng)GC-MS分析后共檢測出7種主要脂肪酸，其中飽和脂肪酸有4種，包括月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸和二十四烷酸；不飽和脂肪酸有3種，包括亞油酸、油酸和二十碳烯酸。種子油體經(jīng)GC-MS分析后共檢測出4種主要脂肪酸，即油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，脂肪酸總離子流圖見圖2。從表1可知，在所檢測到的油體脂肪酸中油酸含量最高，海安種子、朱集種子油體中的油酸含量分別為8332%、73.99%，且差異顯著（P<0.05）；其次是棕櫚酸，海安種子的含量（10.56%）顯著低于朱集種子（15.97%）。2種種子油體中的亞油酸和硬脂酸含量基本相同，且差異不顯著。上述4種脂肪酸在2種種子中的含量分布情況與油體種子中的相對(duì)含量情況基本相似，均以油酸含量最高，其中海安種子的油酸含量為82.04%，顯著高于朱集種子的7563%。海安種子、朱集種子中棕櫚酸的含量在分別為600%、1175%，差異顯著（P<0.05）。

在提取油體過程中，加入正己烷是為了去除結(jié)構(gòu)不完整的油體，因此得到的正己烷相含有油體破碎時(shí)產(chǎn)生的脂肪酸。GC-MS分析結(jié)果（表1）顯示，正己烷相中的脂肪酸同樣是油酸占絕大部分（海安種子為67.72%，朱集種子為7782%），其次是棕櫚酸（海安種子為26.07%，朱集種子為1609%），還有少量的亞油酸和硬脂酸。綜上所述，2種種子和油體中的脂肪酸以油酸和棕櫚酸為主，且相對(duì)含量差異顯著。種子脂肪酸中的油酸含量與棕櫚酸含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，即油酸含量高的種子（海安種子的82.04%>朱集種子的75.63%），則棕櫚酸含量較低（海安種子的6.00%<朱集種子的11.75%），這為能源植物續(xù)隨子的高油育種研究提供了新視角。油體中4種脂肪酸的組成比例與種子中的情況類似，這可能是因?yàn)榉N子中的脂肪酸大部分儲(chǔ)存在油體中。另外，在種子中檢測到了二十四烷酸，而油體和正己烷相中均未檢出，這可能是由于在油體的提取過程中，二十四烷酸并沒有被富集在油體提取液中。

2.3 油體極性脂與中性脂的脂肪酸組成分析

將油體中的極性脂和中性脂分離后，分別進(jìn)行GC-MS檢測，分析其脂肪酸組成，結(jié)果見表2。由表2可知，油體極性脂和中性脂的主要脂肪酸均以十八碳烯酸（油酸，含1個(gè)不飽和雙鍵）為主，其次是十六烷酸。值得注意的是，在種子來源不同（海安種子和朱集種子）的中性脂中，主要的脂肪酸相對(duì)含量相似；而在極性脂中，主要的脂肪酸相對(duì)含量有較大差異，尤其是十八碳烯酸（海安種子65.64%和朱集種子7257%）和十六烷酸（海安種子21.02%和朱集種子1337%）。這種十八碳烯酸與十六烷酸呈負(fù)相關(guān)的脂肪酸組成形式與油體中脂肪酸組成形式是一致的。在油體形成過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的磷脂酰膽堿（一種極性脂）能被用于細(xì)胞膜脂和TAG（中性脂）的合成，可見極性脂與中性脂之間存在轉(zhuǎn)化關(guān)系[9]。十八碳烯酸與生物柴油的理想分子相近[8]，因此在續(xù)隨子的定向育種中可以考慮十八碳烯酸與十六烷酸的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即提高十八碳烯酸含量，降低十六烷酸含量。在油體的結(jié)構(gòu)組成中，中性脂（TAG）占據(jù)了絕大部分空間，而極性脂（磷脂）只存在于油體的表面，因此中性脂含量比極性脂含量多很多；另外，在中性脂中還檢測到了二十碳烯酸，而極性脂中檢測到了十二碳烷酸。

3 結(jié)論

本研究建立了能源植物續(xù)隨子種子油體的提取方法，提取了來源于江蘇海安和河南朱集2個(gè)產(chǎn)地的續(xù)隨子種子油體。結(jié)果顯示，海安種子和朱集種子油體的脂肪酸以油酸（83.32%和73.99%）和棕櫚酸（10.56%和15.97%）為主；種子中的脂肪酸以油酸（82.04%和75.63%）和棕櫚酸（600%和1175%）為主，且油酸含量與棕櫚酸含量呈負(fù)相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chen B C，Mcclements D J，Gray D A. Physical and oxidative stability of pre-emulsified oil bodies extracted from soybeans[J]. Food Chemistry，2012，132（3）：1514-1520.

[2]Huang A H C. Oil bodies and oleosins in seeds[J]. Annual Review of Plant Biology，1992，43：177-200.

[3]Nikiforidis C V，Kiosseoglou V，Scholten E. Oil bodies：an insight on their microstructure-maize germ vs sunflower seed[J]. Food Research International，2013，52（1）：136-141.

[4]Jolivet P，Acevedo F，Boulard C A，et al. Crop seed oil bodies：from challenges in protein identification to an emerging picture of the oil body proteome[J]. [HJ1.9mm]Proteomics，2013，13（12/13）：1836-1849.endprint

[5]Tzen J T，Huang A H. Surface-structure and properties of plant seed oil bodies[J]. Journal of Cell Biology，1992，117（2）：327-335.

[6]Payne G，Lad M，F(xiàn)oster T，et al. Composition and properties of the surface of oil bodies recovered from Echium plantagineum[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2014，116（116）：88-92.

[7]危文亮，金夢(mèng)陽，馬 沖，等. 續(xù)隨子油脂肪酸組成分析[J]. 中國油脂，2007，32（5）：70-71.

[8]Wang R，Hanna M A，Zhou W W，et al. Production and selected fuel properties of biodiesel from promising non-edible oils：Euphorbia lathyris L.，Sapium sebiferum L. and Jatropha curcas L[J]. Bioresource Technology，2011，102（2）：1194-1199.

[9]Katavic V，Agrawal G K，Hajduch M，et al. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivars[J]. Proteomics，2006，6（16）：4586-4598.

[10]David A，Yadav S，Bhatla S C. Plant oil bodies and oleosins：structure，function and biotechnological applications[M]//Bernd H A. Bionanotechnology：biological self-assembly and its applications.Norfolk，England：2013：187.endprint