毛曉晶，曾 洋，韓 欽*，趙春華*

(1.中國醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所 組織工程中心， 北京 100005；2.清華大學 醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程， 北京 100084)

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明膠微冰膠支架有利于脂肪來源間充質(zhì)干細胞體外干性維持并提高其體內(nèi)應用價值

毛曉晶1，曾 洋2，韓 欽1*，趙春華1*

(1.中國醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所 組織工程中心， 北京 100005；2.清華大學 醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程， 北京 100084)

目的研究人脂肪來源間充質(zhì)干細胞(ADSCs)與明膠微冰膠材料體外聯(lián)合培養(yǎng)時，材料是否能維持間充質(zhì)干細胞的生物學特性。方法ADSCs種植于明膠微冰膠材料后進行Calcein-AM和PI活細胞染色檢測細胞活力，細胞滴度藍法檢測細胞增殖能力，定量PCR檢測干性基因OCT4、Nanog、SOX2表達情況，以及在成脂成骨誘導過程比較ADSCs在二維環(huán)境和種植于明膠微冰膠材料后的分化潛能。結(jié)果ADSCs在三維明膠微冰膠支架材料中能保持較高活性，增殖能力不受影響，干性基因表達上調(diào)，成脂成骨分化相關基因表達水平比二維誘導環(huán)境低。結(jié)論明膠微冰膠可以為ADSCs提供一個較二維培養(yǎng)更好的微環(huán)境，有利于ADSCs體外干性維持，從而在干細胞移植法治療相關疾病時以非侵入性的細胞傳遞方式發(fā)揮更長期的應用價值。

人脂肪間充質(zhì)干細胞；明膠微冰膠

成體干細胞中人脂肪來源間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells from adipose tissue,hADSCs)迄今已廣泛應用于組織工程學基礎研究和臨床前期研究中。ADSCs具有三方面優(yōu)勢：一是具有自我更新能力和三胚層分化潛能，如分化成脂肪細胞、成骨細胞、內(nèi)皮細胞、表皮細胞、神經(jīng)元、肝臟細胞等；二是來源豐富，取材方便，可以大量獲取種子細胞；三是具有免疫調(diào)節(jié)功能，能降低炎性反應和移植排斥反應發(fā)生率[1]。ADSCs在正常機體可以一生維持未分化狀態(tài)，但是在體外培養(yǎng)瓶或皿中時，會經(jīng)歷老化過程，增殖能力減弱[2]。因此間充質(zhì)干細胞(MSC)在不確定的體內(nèi)外環(huán)境中干性狀態(tài)能否維持是長期臨床應用主要考慮的問題[3]。

生物學支架材料，如膠原、明膠、纖連蛋白和透明質(zhì)酸，可用于體外培養(yǎng)ADSCs。明膠是膠原蛋白水解后產(chǎn)物，是一種無味、半透明、堅硬的薄片、顆?；蚍勰钗镔|(zhì)，廣泛應用于組織工程中。本研究中使用的明膠微冰膠(gelatin microcryogels)在以前的研究中曾應用于小鼠下肢缺血模型。細胞在明膠微冰膠中用常規(guī)胰蛋白酶消化法能夠傳代生長，二者存在相互作用，本研究將進一步探索在體外培養(yǎng)環(huán)境中，生物可降解性的明膠微冰膠三維支架材料如何影響ADSCs增殖分化潛能和干性狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 試劑

人無菌脂肪組織(西宮整形美容機構(gòu)，遵循知情同意原則)；明膠(Sigma-Aldrich公司)；Cell Titer-Blue? Cell Viability Assay(Promega公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR定量PCR試劑盒(Takara公司)；油紅O、茜素紅(Sigma公司)；堿性磷酸酶染色試劑盒(天津血液研究所)。

1.2 ADSCs和明膠微冰膠體外聯(lián)合培養(yǎng)

生物可降解的明膠微冰膠由清華大學生物工程系制備，將冷水魚明膠與3%戊二醛溶液按6%的質(zhì)量體積比混合，利用PMM微孔模板技術低溫下制備成的顆粒狀三維支架材料，制備方法簡單、周期短。首先收集狀態(tài)良好的三代ADSCs并計數(shù)，重懸細胞沉淀，以50 μL體積、1.2×107個/mL鋪于一個膠塊上，置于5% CO2和95%濕度的37 ℃培養(yǎng)箱1.5～2 h，使細胞充分貼附在材料中，然后補足培養(yǎng)皿所需培養(yǎng)基，獲得三維明膠微冰膠支架材料(3D)中ADSCs。設置普通二維生長環(huán)境(2D)中ADSCs作為對照。

1.3 種植于明膠微冰膠中ADSCs活細胞染色

從培養(yǎng)皿中吸取數(shù)粒含有ADSCs的明膠顆粒狀材料置于48孔板，D-Hank’s洗掉培養(yǎng)基。避光配制死活細胞染色液，PI(10 μg/mL)和Calcein-AM(2 μmol/L)稀釋于D-Hank’s中。將該混合物加入48孔板中，37 ℃孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 Cell Titer-Blue?細胞活力檢測

以1.2×107個/mL接種ADSCs，比較細胞在普通二維生長環(huán)境(2D)和三維明膠微冰膠支架材料(3D)增殖能力，具體操作方法按照說明書進行。

1.5 2D和3D中ADSCs成脂成骨誘導過程

以2×104個/mL將ADSCs鋪于6孔板，待細胞增殖至培養(yǎng)皿60%和80%，分別添加成骨和成脂誘導液，于誘導第5天進行成骨堿磷酶染色，于第10天進行成脂油紅O和成骨茜素紅染色。以1.2×107個/mL接種ADSCs于明膠微冰膠中，誘導方法同上，收集RNA鑒定成脂成骨相關基因表達情況。

1.6定量PCR檢測2D和3D中ADSCs干性基因表達情況

用Trizol法提取體外2D和3D培養(yǎng)環(huán)境中ADSCs的RNA，測定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。Real-time PCR按照試劑盒說明書進行。RT-PCR引物序列(表1)，以GAPDH作為內(nèi)參。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1ADSCs和明膠微冰膠形態(tài)及其聯(lián)合培養(yǎng)后活細胞染色結(jié)果

ADSCs培養(yǎng)擴增至第3代后細胞增殖形態(tài)比較一致(圖1A)。明膠微冰膠制備后呈現(xiàn)于培養(yǎng)皿，電鏡照片顯示明膠微冰膠是帶有空隙的三維立體結(jié)構(gòu)(圖1B)，肉眼觀察到材料顆粒是直徑400 μm的白色柱狀實體(圖1C)。這種材料需經(jīng)過進一步凍干處理，存于-20 ℃?zhèn)溆?，進而形成厚度600 μm左右圓形或者方形片狀的顆粒聚集體(圖1D)。在細胞和材料體內(nèi)應用前，活細胞染色顯示材料中細胞大部分處于存活狀態(tài)(Calcein-AM：陽性綠色)(圖1E,G)，僅有少部分細胞死亡(PI:陽性紅色)(圖1F,G)。

2.2ADSCs在明膠微冰膠中增殖情況和干性基因表達情況

以1.2×107個/mL接種，初始細胞數(shù)量相同，結(jié)果顯示連續(xù)培養(yǎng)3 d兩組間的細胞增殖無區(qū)別(圖2A)。同時還分析了ADSCs干性基因的表達情況，結(jié)果顯示培養(yǎng)12 h后OCT4、Nanog表達水平在3D環(huán)境中明顯高于2D(圖2B)。

A.ADSCs morphology(×10)；B～D.gelatin microcryogels morphology,B(×100),D(×20)；E～G.ADSCs staining in gelatin microcryogels of Calcein-AM and PI(×20)

A.ADSCs proliferation；B.expression of stemness genes OCT4， Nanog,SOX2 in gelatin microcryogels (3D) compared to 2D； *P<0.05，**P<0.01 compared with ADSCs

2.3ADSCs在二維環(huán)境和三維明膠微冰膠中成脂成骨分化能力比較

3種染色結(jié)果顯示,普通二維培養(yǎng)條件和明膠微冰膠三維培養(yǎng)條件下，ADSCs都具有向成脂和成骨分化的能力(圖3)。明膠微冰膠中ADSCs在誘導5和10 d時，成脂分化相關基因PPARγ、AP2、LPL以及成骨分化基因RUNX2、OPN、OC表達水平均比二維誘導環(huán)境降低(圖4A～F)。

A～B.oil red O staining adipogenic differentiation of ADSCs(×10)；C～D.ALP staining osteogenic differentiation of ADSCs(×4)； E～F.Alizarin red S staining osteogenic differentiation of ADSCs(×4)；A,C,E(2D); B,D,F(3D)

A～C.adipogenic genes expression；D～F.bone differentiation related gene expression；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.01 compared with ADSCs+microcryogels

3 討論

干細胞微環(huán)境對干細胞命運決定非常關鍵，包括體內(nèi)和體外微環(huán)境兩方面。不同的環(huán)境因素，如干細胞和干細胞之間、干細胞和臨近分化細胞之間相互作用，以及干細胞受到周圍黏附分子、細胞外基質(zhì)成分、氧張力、生長因子、細胞因子，理化環(huán)境中pH、離子強度、代謝產(chǎn)物影響，都會改變基因表達，誘導其增殖或者分化，從而影響干細胞參與組織再生、維持和修復過程[2]。

種子細胞、組織工程支架、細胞因子是構(gòu)成組織工程的3 大因素，分別相當于田地里的種子、土壤、化肥。作為“土壤”的組織工程支架起細胞外基質(zhì)作用，不但為種子細胞提供附著、生長、增殖的場所，而且向種子細胞傳輸化學和力學信號,指導種子細胞的誘導分化、基因表達，使其再生或修復組織[4- 5]。

本研究顯示ADSCs在明膠微冰膠中能夠正常增殖，活性較高，與ADSCs在普通二維生長環(huán)境相比差別不明顯。進一步分析干細胞標記基因OCT- 4、SOX- 2和Nanog[6]在二維和三維環(huán)境中的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在明膠微冰膠中ADSCs干性基因表達水平高于二維生長環(huán)境。這部分結(jié)果提示明膠微冰膠作為細胞載體提供了一個比普通二維更好的環(huán)境因素，不但保持了ADSCs較強的增殖能力，而且提高了ADSCs干性基因表達水平。此外，種植于明膠微冰膠三維支架材料中的ADSCs在成脂成骨誘導環(huán)境下，成脂和成骨染色結(jié)果顯示具有相似的成脂成骨分化能力，但是相關基因表達上調(diào)沒有普通二維誘導環(huán)境顯著。結(jié)合干性基因的檢測結(jié)果提示明膠微冰膠三維支架材料提供的環(huán)境因素更有利于ADSCs維持干性。 另外，明膠微冰膠材料在體內(nèi)應用時，優(yōu)勢在于可以采用直接輸注的方式，因此有利于提高ADSCs的體內(nèi)應用價值。

[1] Yi T，Song SU. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells and their therapeutic applications[J]. Arch Pharm Res，2012，35：213- 221.

[2] Scadden DT. The stem-cell niche as an entity of action[J]. Nature，2006, 441：1075- 1079.

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Gelatin microcryogels benefit human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue to maintain stemnessinvitroand promote application valueinvivo

MAO Xiao-jing1, ZENG Yang2, HAN Qin1*, ZHAO Chun-hua1*

(1.Center of Excellence in Tissue Engineering, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005；2.Dept. of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

ObjectiveTo investigate whether the gelatin microcryogels can maintain biological characteristics of human mesenchymal stem cells from adipose tissue (ADSCs) and enhance the stemness of ADSCs when they are co-culturedinvitro.MethodsCalcein-AM and PI staining were conducted to test cell viability of ADSCs plated in gelatin microcryogels. Cell titer-blue assay was used to examine the cellular proliferating capacity. Real-time PCR was used to evaluate the expression level of the stemness genesOCT4,Nanog,SOX2. Adipogenic and osteogenic differentiation were induced and compared in ADSCs plated in gelatin microcryogels and in conventional environment.ResultsADSCs were biologically active in the 3D scaffolds of gelatin microcryogels. Proliferation rate was not influenced. Stemness genes expression was up-regulated. ADSCs plated in gelatin microcryogels still had osteogenic and adipogenic differentiation ability, but the related genes expression levels were lower in comparison with ADSCs in conventional inducing condition.ConclusionsGelatin microcryogels can provide proper microenvironmental factors for ADSCs stemness maintenance, so as to exert the long-term application value in the diseases treated

human mesenchymal stem cells from adipose tissue(hADSCs); gelatin microcryogels

2015- 01- 11

：2015- 03- 13

國家重大科學研究計劃(2011CB964901)

*通信作者(correspondingauthor)：hanqinhanqin@126.com；zhaochunhua@vip.163.com

1001-6325(2015)05-0610-05

研究論文

Q813.1

：A

with stem cell by a minimally-invasive delivery method.