游 偉，劉映峰，張杰波，林湧灤，繆 緋，劉 芃

(南方醫(yī)科大學 珠江醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510282)

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HBSP抑制缺氧復氧心肌H9C2細胞Omi/HtrA2胞內(nèi)轉(zhuǎn)位及細胞凋亡

游 偉，劉映峰，張杰波，林湧灤，繆 緋，劉 芃*

(南方醫(yī)科大學 珠江醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510282)

目的探討促紅細胞生成素衍生肽(HBSP)對缺氧復氧心肌細胞Omi/HtrA2胞內(nèi)轉(zhuǎn)位及細胞凋亡的影響。方法將乳鼠心肌細胞(H9C2 細胞)分為對照(Ctrl)組、缺氧復氧(H/R)組、HBSP組和EPO組。培養(yǎng)結束后MTS法檢測細胞存活率，酶標儀檢測細胞上清液中LDH釋放率，Western blot檢測細胞內(nèi)cleaved caspase- 3表達，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡；分離H9C2細胞胞質(zhì)及線粒體，Western blot分別檢測線粒體及細胞質(zhì)Omi/HtrA2表達。結果與Ctrl組相比，H/R 組細胞存活率下降(P<0.05)，LDH釋放、cleaved caspase- 3表達、心肌細胞凋亡及Omi/HtrA2胞內(nèi)轉(zhuǎn)位均明顯上升(P<0.05)；與H/R組相比，EPO組的細胞存活率升高(P<0.05)，LDH釋放降低、cleaved caspase- 3表達減弱、心肌細胞凋亡減少、Omi/HtrA2線粒體轉(zhuǎn)位明顯減少(P<0.05)；隨著HBSP濃度的增加，各組細胞存活率逐漸上升，LDH釋放、cleaved caspase- 3表達、心肌細胞凋亡及Omi/HtrA2胞內(nèi)轉(zhuǎn)位率逐漸下降 (P<0.05)。結論HBSP具有與EPO類似的保護作用，可抑制經(jīng)H/R誘導的心肌細胞凋亡，其機制可能是通過減少Omi/HtrA2蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)位，抑制caspases通路激活，進而發(fā)揮細胞保護作用。

缺氧復氧；促紅細胞生成素衍生肽；促紅細胞生成素；細胞凋亡；Omi/HtrA2

在現(xiàn)階段急性心肌梗死患者的再灌注治療中，無論是溶栓還是冠脈介入治療，心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)都是臨床醫(yī)生無法回避的問題及難以攻克的治療難點。然而缺血/再灌注(I/R)的機制至今仍未完全闡明，目前臨床上尚無有效的治療方法。近10年來，體內(nèi)外大量的實驗[1- 2]證實促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)在心肌梗死、MIRI、心力衰竭等模型中起到良好的心肌保護作用。然而，近年來幾個大型臨床研究中[3- 6]，EPO因血栓及高血壓等不良反應，使其臨床推廣受到限制。HBSP是由EPO 3級結構衍生而來的具有11 個氨基酸(序列為QEQLERALNSS)的新型多肽，其生物多效性近年來被廣泛證實。HBSP在缺血再灌注、炎性反應、神經(jīng)創(chuàng)傷等多種生物模型中具有與EPO相似的組織保護作用，又無促紅細胞生成的不良反應[7]。國外最新研究證實，在充血性心力衰竭及心肌梗死模型中，HBSP具有和EPO類似的心臟保護作用。然而HBSP對MIRI的影響鮮有報道。本研究細胞通過體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，建立H/R細胞損傷模型，觀察HBSP對心肌細胞凋亡及Omi/HtrA2轉(zhuǎn)位率的影響，并探討HBSP發(fā)揮心肌保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H9C2 細胞(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院實驗室)、胎牛血清、DMEM-高糖培養(yǎng)基、青霉素、PBS磷酸鉀緩沖液和HBSP(上海科肽生物科技有限公司)；重組EPO注射液(山東科興生物制品有限公司)；cellTiter96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑盒(Promega公司)；乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(賽默飛世爾科技公司)；Cleaved caspase- 3多抗、GAPDH單抗、COX IV單抗、Omi/HtrA2單抗(Cell Signaling公司)；Pluslight ECL kit (ECL發(fā)光試劑盒)(Forevergen Bioscience公司)；原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒(Roche公司)；線粒體胞質(zhì)分離試劑盒(Qiagen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組： 將H9C2細胞分為：1)對照組(Ctrl)：細胞用DMEM-高糖培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26 h，不作任何處理；2)缺氧復氧組(H/R)：將待處理細胞、厭氧袋及氧氣指示劑放入?yún)捬豕?，將厭氧罐置于細胞培養(yǎng)箱，待氧氣指示劑從淺紫色變成粉紅色示無氧狀態(tài)，開始計時缺氧時間，缺氧時間定為2 h，重新將細胞放置培養(yǎng)箱即為復氧狀態(tài)，復氧24 h；3)HBSP組：同缺氧復氧組，在缺氧2 h加入不同濃度的HBSP(2.5、5和10 ng/mL)處理，然后復氧24 h。4)EPO組：同缺氧復氧組，在缺氧2 h后加入(40 IU/mL)的EPO，然后復氧24 h。

1.2.2 MTS法檢測細胞存活率： 取指數(shù)增殖期細胞消化吹散并調(diào)整細胞至1×105/mL，按照實驗分組進行處理，處理后的細胞加入cellTiter96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑，試劑與培養(yǎng)液比例為1∶10，孵育4 h后，酶標儀檢測讀取各樣本AD490數(shù)據(jù)，得出的數(shù)據(jù)通過與對照組比較計算細胞存活率。

1.2.3 細胞上清液LDH濃度檢測： 按實驗設計培養(yǎng)結束后，提取上清液按照乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒說明書操作，測量細胞LDH釋放率：

1.2.4 Western blot檢測cleaved caspase- 3表達: 蛋白用Bradford法定量后，采用15%濃度的聚丙烯酰胺凝膠測cleaved caspase3，經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，將相應的一抗cleaved caspase- 3(Cell Signaling公司#9661，1∶1 000)，4 ℃過夜后，用TBST每次7 min洗兩次后，用相應的稀釋好的二抗(HRP標記二抗，1∶5 000，F(xiàn)orevergen公司)室溫下孵育1～2 h后，用TBST每次7 min洗3次后，進行化學發(fā)光顯影(ECL，F(xiàn)orevergen公司)。用Image J分析目標條帶的吸光度值，比較各組cleaved caspase3/GAPDH(HC301,1∶5 000)吸光度的差異。

1.2.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡: 根據(jù)TUNEL檢測試劑盒進行檢測，以LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡觀察記錄結果。每組細胞計數(shù)10個隨機高倍視野中TUNEL陽性細胞核數(shù)和總細胞核數(shù)。計算TUNEL陽性細胞核數(shù)占總細胞核數(shù)的百分比即為凋亡率。

1.2.6 分離H9C2細胞胞質(zhì)及線粒體，Western blot分別檢測線粒體及細胞質(zhì)Omi/HtrA2蛋白表達：選取10 ng/mL HBSP組細胞為實驗對象，按照線粒體胞質(zhì)分離試劑盒說明書分離線粒體蛋白及胞質(zhì)蛋白，Western blot檢測各組Omi/HtrA2蛋白表達，計算其轉(zhuǎn)位率：

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 心肌細胞存活率變化

與Ctrl組相比，H/R組細胞存活率明顯下降(P<0.05),細胞上清液LDH濃度明顯上升；與H/R組比較，HBSP的3個處理組細胞存活率逐漸升高, 各組細胞上清液LDH濃度逐漸回降(P<0.05)(表1)。

2.2 HBSP對細胞cleaved caspase- 3表達的影響

H/R組細胞cleaved caspase- 3表達較Ctrl組明顯升高(P<0.05)。與H/R組相比，HBSP的2個處理組(5、10 ng/mL)的cleaved caspase- 3表達逐漸回降(P<0.05)(圖1)。

表1 心肌細胞存活率及LDH釋放率的變化

*P<0.05 compared with Ctrl;#P<0.05 compared with H/R.

1.Ctrl；2.H/R；3.HBSP 2.5 ng/mL；4.HBSP 5 ng/mL；5.HBSP 10 ng/mL；6.EPO 40 IU/mL; *P<0.05 compared with Ctrl; #P<0.05 compared with H/R圖1 各組細胞中cleaved caspase- 3的相對表達水平Fig 1 Western blot analysis of cleaved caspase- 3

2.3 各組心肌細胞凋亡率的比較

與Ctrl組相比，H/R組心肌細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，HBSP的2個處理組(5、10 ng/mL)及EPO組細胞凋亡率均明顯回降(P<0.05)(圖2)。2.4胞質(zhì)及線粒體中Omi/HtrA2蛋白的表達情況

Ctrl組中Omi/HtrA2蛋白主要在線粒體內(nèi)(mitochondrion，Mito)表達，在胞質(zhì)(cytoplasma，Cyto)表達極少；H/R組中Omi/HtrA2蛋白在胞質(zhì)中表達明顯增加，在線粒體內(nèi)表達減少，說明缺氧復氧誘導Omi/HtrA2蛋白由線粒體向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位；而HBSP組和EPO組的Omi/HtrA2轉(zhuǎn)位減少，說明HBSP和EPO均可抑制缺氧復氧誘導的Omi/HtrA2轉(zhuǎn)位(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with ctrl group; #P<0.05 compared with H/R group圖2 TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡率Fig 2 The apoptosis of cardiomyocytes in different groups examined by TUNEL staining(×100)

1.Ctrl；2.H/R；3.HBSP 10 ng/mL；4.EPO 40 IU/mL；A，B.expression of Omi/HtrA2 in Cyto(A) and Mito (B)； GAPDH: Cyto marker; COXⅣ:Mito marker; *P<0.05 compared with Ctrl group; #P<0.05 compared with H/R group

3 討論

在過去的10年里，EPO的生物多效性，尤其是對MIRI的保護作用被廣泛證實[8]。由于EPO需要大劑量才能發(fā)揮組織保護作用，而大劑量EPO的不良反應(如高凝狀態(tài)、血栓和高血壓等)難以避免，EPO發(fā)揮組織保護效應在臨床難以推廣。HBSP是從EPO的三級結構helix B 段親水表面中篩選合成而來，沒有促紅細胞生成的不良反應。通過擴張型心肌病倉鼠模擬充血性心力衰竭模型，發(fā)現(xiàn)HBSP可抑制TNF-α誘導的心肌細胞凋亡[9]；有研究[10]通過大鼠心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)HBSP能減小梗死面積，減少左室擴張，提高活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)釋放閾值，具有與EPO同樣的保護效果；另有實驗[11]證實HBSP抑制經(jīng)C反應蛋白誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，降低經(jīng)C反應蛋白誘導THP- 1細胞TNF-α和MM9的表達減輕巨噬細胞泡沫化，顯著抑制心肌梗死兔子冠脈TNF-α表達和減少M1巨噬細胞；此外，在構建大鼠MIRI模型的實驗中，發(fā)現(xiàn)HBSP 可顯著抑制缺血再灌注誘導的大鼠心肌細胞凋亡，大鼠心肌梗死面積亦顯著減少，心功能明顯改善[12]。綜上所述，目前HBSP對心臟保護作用逐漸被證實，然而在MIRI方面，HBSP能否像EPO一樣減輕MIRI以及其具體保護機制尚不明確。本實驗通過建立心肌細胞H/R模型，證實HBSP可抑制H/R誘導的心肌細胞LDH、caspase- 3表達增加，減少H/R誘導的心肌細胞凋亡率，同時觀察到HBSP可抑制H/R心肌細胞Omi/HtrA2蛋白的胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。

Omi/HtrA2蛋白是一種新近發(fā)現(xiàn)的促凋亡蛋白，在蛋白質(zhì)修復和細胞凋亡中有重要作用。Omi/HtrA2在細胞正常生理情況下存在于線粒體膜間隙，當細胞受到凋亡信號刺激時完成自我加工，通過與X-連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)結合，競爭性抑制XIAP與caspase- 9的結合，進而激活處于下游的caspase- 3蛋白表達,引起細胞凋亡。本實驗結果顯示，相比Ctrl組，H/R組Omi/HtrA2蛋白由線粒體轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)中明顯增多，而HBSP組隨HBSP濃度增加Omi/HtrA2蛋白的轉(zhuǎn)位率逐漸減少，提示HBSP可能是通過抑制Omi/HtrA2蛋白由線粒體轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)，進而影響Omi/HtrA2對下游caspase- 9及caspase- 3通路激活作用, 最終減少細胞凋亡。誠然HBSP抑制細胞凋亡可能涉及多種因子，其具體的機制仍需進一步研究。本研究為HBSP的臨床應用提供了一定的實驗基礎和理論依據(jù)。

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新聞點擊

60歲以下女性患糖尿病恐將提高心臟病風險

據(jù)美國國家科學院院報(PNAS)網(wǎng)站2013-11-07報道，一般而言，在60歲以下患冠狀動脈疾病的風險，同年齡層的女性比男性要低，但最近發(fā)表的一項美國研究卻進一步發(fā)現(xiàn)，若本身有心臟病的風險因子之一“糖尿病”，將對這些女性產(chǎn)生與男性不同的影響。

目前約翰霍普金斯大學醫(yī)學院針對3份研究中包含超過1萬名男女參與者的數(shù)據(jù)進行分析，所有參與者都無心臟病病史。結果發(fā)現(xiàn)，60歲以下年輕與中年女性有2型糖尿病的話，她們患冠狀動脈疾病的機會就大幅提高，風險增加了將近4倍之多，該風險數(shù)值已大致與男性心臟病風險相當。不過，糖尿病影響心臟病風險的情形卻在相同年齡層的男性身上并不明顯。

研究表示，其他風險因子如肥胖、高血壓、糖尿病與吸煙對患心臟病的影響在研究中都未被發(fā)現(xiàn)有任何性別差異，唯獨糖尿病對女性心臟病的影響遠遠超過男性。研究推測可能有不同的基因及激素因素影響著不同性別心臟病的發(fā)展過程，同時，不同性別對于醫(yī)囑與治療的順從程度也不一，這也可能是造成差異的原因之一，未來將需要更進一步的研究。

他汀類降血脂藥物(Statins)恐提高患白內(nèi)障風險

據(jù)美國國家科學院院報(PNAS)網(wǎng)站2013-11-08報道，過去針對降血脂藥物Statins的討論包括質(zhì)疑該類藥物對女性的效益不如男性，以及去年美國食品藥物管理局要求該類藥物應加注提高短暫性記憶認知受損、及血糖升高的警語。日前又有一項美國研究指出，使用Statins藥物者比未使用者發(fā)生白內(nèi)障眼疾的風險高，而這個爭議性的發(fā)現(xiàn)早在1980年代藥物出現(xiàn)時就曾被提出。

有關于Statins與白內(nèi)障風險的關系，過去有些研究證實其中因果關系，但也有其他研究卻發(fā)現(xiàn)該類藥物對預防白內(nèi)障具有保護作用，出現(xiàn)兩種截然不同的結論。由于Statins類藥物越來越常被用來作為初級預防用途，且白內(nèi)障使生活質(zhì)量受影響及造成美國健康照護支出的負擔也非常大，因此這個問題相當重要。

這項回溯性研究針對過去兩個共包含超過4萬名參與者的研究進行分析，第一個研究參與者的平均年齡56歲，女性占46%；第2個研究參與者使用Statins的平均年齡為56歲、未使用者為46歲，兩組中的女性各占40%和52%。

最后分析兩個研究的結果顯示，使用Statins藥物都與發(fā)生白內(nèi)障呈現(xiàn)顯著的正向相關性，壞膽固醇(LDL)的數(shù)值愈低時，白內(nèi)障風險反而愈高。其中一個計算出與未使用Statins相比的風險增加數(shù)據(jù)為9%(95% CI 1.02～1.17)。

白內(nèi)障及青光眼主治醫(yī)生Anurag Shrivastava評論此研究時表示，這項研究無法提供使用Statins藥物的患者預防白內(nèi)障的建議，但就一般而言，還是以維持均衡飲食、健康的生活形態(tài)、不抽煙及減少暴露于紫外線，并對糖尿病進行嚴格血糖控制為基本預防建議，同時，醫(yī)生應小心Statins使用者有無并服類固醇，服用這些藥物可能會增加白內(nèi)障及青光眼的發(fā)生。

HBSP inhibits transposition of Omi/HtrA2 and apoptosis of myocardial cells induced by anoxia-reoxygenation

YOU Wei, LIU Ying-feng, ZHANG Jie-bo, LIN Yong-luan, MIAO Fei, LIU Peng*

(Dept. of Cardiovascular Medicine, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282，China)

ObjectiveTo investigate the effect of helix B surface peptide(HBSP) on transposition of Omi/HtrA2 and apoptosis of myocardial cells induced by anoxia-reoxygenation.MethodsNeonatal rat myocardial cells (H9C2 cells) were used to be research object, the cells were divideded into 4 groups：control group, H/R group, HBSP group and EPO group. The cell viability was measured by MTS assay, the concentration of LDH of cell supernatant was assessed by ELISA, the intracellular expression changes of cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Apoptosis of cardiomyocytes was detected by TUNEL.Using mitochondria/cytosol isolation kit to isolate mitochondria from cytosol, Western blot was used to detect the expression of Omi/HtrA2 protein changes in the mitochondrial and cytosolic.ResultsCompared with the control group, H/R group cell survival rate decreased significantly(P<0.05), cell supernatant LDH concentration increased significantly,the expression of cleaved caspase- 3 increased, the cardiomyocyte

anoxia-reoxygenation; HBSP; EPO; apoptosis; Omi/HtrA2

2014- 11- 04

：2015- 01- 23

廣東省自然科學基金(10151051501000038); 廣東省科技計劃(20130319c)

*通信作者(correspondingauthor)：65473751@qq.com

1001-6325(2015)05-0615-06

研究論文

R541

：A

apoptosis and the expression of Omi/HtrA2 protein in the cytoplasm increased significantly (P<0.05). Compared with H/R group, EPO and HBSP group cell survival rate increased, cell supernatant concentrations of LDH, cleaved caspase- 3, cardiomyocyte apoptosis and the Omi/HtrA2 protein in the cytoplasm expression decreased significantly (P<0.05).ConclusionsH/R can induce apoptosis of myocardial cell,which can be reduced by EPO or HBSP,its mechanism may be related to the inhibition of Omi/HtrA2 protein in mitochondrial translocation, thus inhibiting the caspases pathway activation.