桂紅珍，楊 浪，金 鵬，盛劍秋

(北京軍區(qū)總醫(yī)院 消化內(nèi)科， 北京 100700)

?

研究論文

褪黑素減輕浸水-束縛應(yīng)激大鼠胃黏膜損傷

桂紅珍，楊 浪，金 鵬，盛劍秋*

(北京軍區(qū)總醫(yī)院 消化內(nèi)科， 北京 100700)

目的探討褪黑素(MT)對(duì)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍的保護(hù)作用及對(duì)胃黏膜MMP-9、MMP-2 和TIMP-2表達(dá)的影響。方法用浸水-束縛應(yīng)激(WIRS) 建立大鼠應(yīng)激性潰瘍模型。應(yīng)激前30 min，分別腹腔注射褪黑素10、20、40和60 mg/kg。應(yīng)激3 h后，觀察大鼠胃黏膜病變，對(duì)潰瘍指數(shù)(UI)進(jìn)行評(píng)分；組織學(xué)觀察胃出血；用real-time PCR及Western blot檢測(cè)胃黏膜MMP-9、MMP-2和TIMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果WIRS應(yīng)激3 h能成功誘導(dǎo)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍。預(yù)先注射MT可明顯降低應(yīng)激性胃潰瘍大鼠的UI(P<0.01)，明顯降低黏膜層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)(P<0.01)。WIRS誘導(dǎo)大鼠胃黏膜MMP-9和MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，TIMP-2則下降；MT預(yù)處理后，MMP-2/MMP-9明顯下降(P<0.05或P<0.01)； 而TIMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論MT可能通過下調(diào)MMP-9和MMP-2表達(dá)，及增加TIMP-2表達(dá)，減輕WIRS誘導(dǎo)的大鼠應(yīng)激性胃潰瘍。

應(yīng)激；胃潰瘍；褪黑素；基質(zhì)金屬蛋白酶；細(xì)胞外基質(zhì)

胃潰瘍的發(fā)病與胃組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重塑的調(diào)節(jié)異常有關(guān)[1-2]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)選擇性降解ECM的成分，在ECM重塑中起重要作用。MMPs是一組Zn2+依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶，在多種炎性反應(yīng)疾病發(fā)病中起重要作用，其中MMP-9和MMP-2對(duì)大鼠急性和慢性胃潰瘍具有不同的調(diào)節(jié)作用[3]；其活性受轉(zhuǎn)錄、分泌、酶原激活及金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)調(diào)節(jié)[4]。

褪黑素(melatonin,MT)是一種內(nèi)源性物質(zhì)，主要由松果體分泌，在胃腸道中有較高的活性，近年來發(fā)現(xiàn)MT通過增強(qiáng)谷胱甘肽水平、減少髓過氧物酶、防止脂質(zhì)過氧化作用保護(hù)吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍[5-6]。MT對(duì)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍MMPs的影響如何？本研究探討MT對(duì)大鼠胃黏膜MMP-2、MMP-9及TIMP-2表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討MT對(duì)應(yīng)激性胃黏膜損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑

SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，6周齡，180～220 g(維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)34760)。MT及SDS-PAGE試劑(Sigma公司)， Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，PCR引物(生工生物工程(上海)有限公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，real-time PCR擴(kuò)增試劑盒(北京中原領(lǐng)先科技有限公司)，MMP-9和MMP-2一抗(Millipore公司)，GAPDH一抗(康成生物)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥：將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、應(yīng)激+MT組(再分10、20、40、60 mg/kg組，應(yīng)激前30 min腹腔注射預(yù)處理)。應(yīng)激+MT組于應(yīng)激前30 min腹腔注射預(yù)處理，模型組應(yīng)激前30 min腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液。常規(guī)WIRS誘導(dǎo)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍模型。

1.2.2 潰瘍指數(shù)(ulcer index，UI)測(cè)定：浸水應(yīng)激3 h、乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死動(dòng)物，進(jìn)行UI評(píng)估[7]：點(diǎn)狀出血為1分，線狀出血長(zhǎng)度<1 mm為2分，1～2 mm為3分，2～4 mm為4分，>4 mm為5分，寬度>1 mm時(shí)分值×2。每只動(dòng)物的累計(jì)總分即為該動(dòng)物的潰瘍指數(shù)。潰瘍抑制率(%)= (模型組潰瘍指數(shù)均值-實(shí)驗(yàn)組潰瘍指數(shù)均值/模型組潰瘍指數(shù)均值) ×100 %。

1.2.3 組織學(xué)觀察:評(píng)估UI之后切取部分胃組織，常規(guī)組織病理制片進(jìn)行組織學(xué)觀察，在400倍顯微鏡下，分別記錄黏膜層5個(gè)不同視野內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量，取平均數(shù)作為該標(biāo)本的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)：載玻片均勻刮取胃黏膜，Trizol法提取胃黏膜組織總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。擴(kuò)增引物序列見表1。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 10 min，循環(huán)45次。用2-ΔΔCT法計(jì)算各個(gè)樣本目的基因的表達(dá)變化[8]。

表1 擴(kuò)增基因引物序列Table 1 Amplification gene sequence primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠UI測(cè)定結(jié)果

大鼠經(jīng)束縛-浸水應(yīng)激3 h，建立了SD大鼠應(yīng)激性胃潰瘍模型。模型組大鼠的整個(gè)胃組織上皮表面可見大量的出血點(diǎn)。與模型組比較， MT20、40及60 mg/kg組的UI均顯著低于模型組(P<0.01)，而且MT劑量越大，UI值越小(表2，圖1)。

表2 各組潰瘍指數(shù)、潰瘍抑制率比較Table 2 Comparison of ulcer index,ulcer inhibition rate(n=10)

*P< 0.01 compared with model group.

2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果

模型組中可見胃小凹連續(xù)性中斷和腺上皮凋亡，糜爛灶形成。MT預(yù)處理的各組別中， MT 10 mg組病變?nèi)悦黠@，與模型組差別不大；但隨著MT劑量加大，病變逐漸減輕，MT 60 mg組可明顯預(yù)防應(yīng)激胃黏膜的形成。MT 20、40及MT 60 mg/kg組黏膜層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)均顯著低于模型組(P<0.01)(圖2)。

2.3 MT預(yù)處理對(duì)WIRS大鼠胃黏膜MMP-2、MMP-9 及TIMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠胃黏膜MMP-2及MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。MT 10、20、40和60 mg/kg預(yù)處理組與模型組比較均明顯下降(P<0.0 5或P<0.01)。而TIMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)趨勢(shì)與之相反， MT 40、60 mg/kg預(yù)處理組與模型組比較均明顯升高(P<0.0 5) (圖3)。

A.blank control; B.model group; C.MT 10 mg/kg; D.MT 20 mg/kg; E.MT 40 mg/kg; F.MT 60 mg/kg圖1 MT預(yù)處理后浸水-束縛應(yīng)激大鼠的胃組織形態(tài)學(xué)Fig 1 Morphology of gastric tissues pre-treated by MT in water-immersion and restraint stress (WIRS) rats

A.blank control; B.model group; C.MT 10 mg/kg; D.MT 20 mg/kg; E.MT 40 mg/kg; F.MT 60 mg/kg圖2 MT預(yù)處理后浸水-束縛應(yīng)激大鼠的胃組織病理圖Fig 2 Histological appearances of gastric tissues pre-treated by MT in water-immersion and restraint stress(WIRS) rats(×200)

A.mRNA level of MMP-2; B.mRNA level of MMP-9; C.mRNA level of TIMP-2; D.protein level of MMP-2; E.protein level of MMP-9; F.protein level of TIMP-2; G.representative Western blot of MMP-2,MMP-9 and TIMP-2; #P<0.01 compared with blank control group；*P<0.05 compared with model group; **P<0.01 compared with model group圖3 MT對(duì)WIRS大鼠胃黏膜MMP-2、MMP-9及TIMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effect of melatonin on MMP-2,MMP-9 and TIMP-2 mRNA expression and protein level in rat mucosa duringprevention of WIRS-induced gastric damage (n=6)

3 討論

應(yīng)激是急性胃黏膜病變的主要原因之一，通過引起胃酸向胃黏膜逆向擴(kuò)散，胃黏膜血流減少，抑制黏膜前列腺素產(chǎn)生，黏液素減少，氧化應(yīng)激增加，中性粒細(xì)胞激活，胃黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)和增生抑制等機(jī)制引起胃損傷[9-10]。應(yīng)激因素可能長(zhǎng)期存在，而目前長(zhǎng)期應(yīng)用抑酸藥預(yù)防潰瘍易引起并發(fā)癥。因此有必要探索其他作用強(qiáng)、不良反應(yīng)小的預(yù)防潰瘍的藥物。本研究觀察MT對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)生的影響，結(jié)果顯示MT 40 mg/kg對(duì)WIRS誘導(dǎo)的大鼠胃損傷具有保護(hù)作用，隨著劑量增加效果更加明顯。

培養(yǎng)的胃上皮細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9[11-12]，提示ECM蛋白和ECM降解酶(MMPs)參與胃潰瘍發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)WIRS大鼠胃黏膜MMP-9、MMP-2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)上調(diào)，支持MMPs參與應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生。與本研究結(jié)果類似，在大鼠慢性胃潰瘍模型進(jìn)行的研究中，吲哚美辛可引起MMP-2和MMP-9活性增加，表明MMPs參與胃十二指腸潰瘍發(fā)病[3,13]。在基因和蛋白水平調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，是胃潰瘍形成和愈合過程中ECM降解和重塑的潛在機(jī)制[14]。有關(guān)應(yīng)激性潰瘍MMPs的表達(dá)、釋放和激活形成活化形式的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究顯示，應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃組織MMP-9和MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)同時(shí)， TIMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)增加，提示TIMP-2可能通過調(diào)節(jié)MMP-9和MMP-2活性，共同參與應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)MT能反向抑制MMP-9和MMP-2并同時(shí)增加TIMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)。與本研究結(jié)果一致，在乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍模型中，MT能反向抑制TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)[15]。提示MT可能通過調(diào)節(jié)MMPs和TIMP預(yù)防應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生，然而其具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

總之， MT可能通過下調(diào)MMP-9和MMP-2表達(dá)及增加TIMP-2表達(dá)，減輕WIRS誘導(dǎo)的大鼠應(yīng)激性胃潰瘍。MT可能是治療應(yīng)激性胃潰瘍的具有前景的重要補(bǔ)充，了解MT對(duì)潰瘍的MMP調(diào)節(jié)機(jī)制，有助于MT未來應(yīng)用于控制臨床疾病的必要基礎(chǔ)。

[1] Shahin M,Konturek JW,Pohle T,etal.Remodeling of extracellular matrix in gastric ulceration [J].Microsc Res Tech,2001,53:396-408.

[2] Ganguly K,Swarnakar S.Chronic gastric ulceration causes matrix metalloproteinases-9 and-3 augmentation:alleviation by melatonin [J].Biochimie.2012,94:2687-2698.

[3] Lempinen M,Inkinen K,Wolff H,etal.Matrix metalloproteinases 2 and 9 in indomethacin-induced rat gastric ulcer [J].Eur Surg Res,2000,32:169-176.

[4] English JL,Kassiri Z,Koskivirta I,etal.Individual TIMP deficiencies differentially impact pro-MMP-2 activation [J].J Biol Chem,2006,281:10337-10346.

[5] Ganguly K,Maity P,Reiter RJ,etal.Effect of melatonin on secreted and induced matrix metalloproteinase-9 and-2 activity during prevention of indomethacin-induced gastric ulcer [J].J Pineal Res,2005,39:307-315.

[6] Brzozowska I,Strzalka M,Drozdowicz D,etal.Mechanisms of esophageal protection,gastroprotection and ulcer healing by melatonin.implications for the therapeutic use of melatonin in gastroesophageal reflux disease (GERD) and peptic ulcer disease[J].Curr Pharm Des.2014,20:4807-4815.

[7] Konturek PC,Konturek SJ,Brzozowski T,etal.Gastroprotective activity of melatonin and its pr-ecursor，L-tryptophan，against stress-induced and is chemia-induced lesions is mediated by scavenge of oxygen radicals [J].Scand J Gastroenteerol,1997,32:433-438.

[8] 楊海靜，陳衛(wèi)，權(quán)金星，等.油酸調(diào)節(jié)人血管平滑肌細(xì)胞TLR4 的增殖活性及炎性因子的表達(dá)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013,33:44-48.

[9] Konturek PC,Brzozowski T,Konturek SJ.Stress and the gut:pathophysiology,clinical consequences,diagnostic approach and treatment options[J].J Physiol Pharmacol,2011,62:591-599.

[10] Izgüt-Uysal VN1,Gemici B,Birsen I,etal.The protective effect of apelin against water-immersion and restraint stress-induced gastric damage[J].J Physiol Sci,2014,64:279-289.

[11] Gooz M,Shaker M,Gooz P,etal.Interleukin 1beta induces gastric epithelial cell matrix metalloproteinase secretion and activation during Helicobacter pylori infection [J].Gut,2003,52:1250-1256.

[12] Pillinger MH,Marjanovic N,Kim SY,etal.Matrix metalloproteinase secretion by gastric epithelial cells is regulated by E prostaglandins and MAPKs[J].J Biol Chem 2005; 280:9973-9979.

[13] Baragi VM,Qiu L,Gunja-Smith Z,etal.Role of metalloproteinases in the development and healing of acetic acidinduced gastric ulcer in rats [J].Scand J Gastroenterol,1997,32:419-426.

[14] Swarnakar S,Ganguly K,Kundu P,etal.Curcumin regulates expression and activity of matrix metalloproteinases 9 and 2 during prevention and healing of indomethacin-induced gastric ulcer [J].J Biol Chem,2005,280:9409-9415.

[15] Swarnakar S,Mishra A,Ganguly K,etal.Matrix metalloproteinase-9 activity and expression is reduced by melatonin during prevention of ethanol-inducedgastric ulcer in mice [J].J Pineal Res,2007,43:56-64.

Melatorin alleviates gastric mucosal injury induced by water-immersion and restraint seress in rats

GUI Hong-zhen,YANG Lang,JIN Peng,SHENG Jian-qiu*

(Dept.of Gastroenterology,the Military General Hospital of Beijing PLA,Beijing 100700,China)

Objective To investigative the protective effects of melatonin (MT) in gastric stress ulcer of rat and expression of MMP-9,MMP-2 and TIMP-2 in mucosa.Methods Stress ulcer model was established by water-immersion and restraint stress (WIRS).Melatonin at dose of 10,20,40,60 mg/kg were administrated in different group of rat at 30 min before the onset of WIRS.The rat mucosa was examined and ulcer index was evaluated after 3 hours stress.Mucosa hemorrhage was determined by histology.In addition,the mRNA and protein levels of MMP-9,MMP-2 and TIMP-2 were measured by PCR and western blot.Results The rat stress ulcer model can be established by WIRS at 3 hours.Pre-administration of melatonin can decrease the ulcer index (UI) and inflammatory cells in mucosa(P<0.01).In addition,the mRNA and protein level of MMP-9 and MMP-2 was increased,TIMP-2 was decreased in WIRS induced rat ulcer model (P<0.01).Moreover,the mRNA and protein level of MMP-2 and MMP-9 was inhibited,while TIMP-2 was promoted by melatonin in stress induced ulcer(P<0.05 orP<0.01).Conclusions The alleviation role of Melatonin on WIRS-induced gastric mucosal injury in rats may partly exert through regulating the expression of MMP-2,MMP-9 and TIMP-2.

stress; gastric ulcer; melatonin; matrix metal protein ases; extracellular matrix

2014-09-18

2014-12-02

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研項(xiàng)目(BWS11J058)

*通信作者(corresponding author)：lina201207012@163.com

1001-6325(2015)03-0318-05

R573.1

A