馮惠平，賈新未，王艷飛，張 芳，張?zhí)m芳，解俊敏

(河北大學(xué) 附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 保定071000)

心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖在心肌纖維化中起重要作用。已有報(bào)道CFs 具有誘導(dǎo)型一氧化氮合酶——一氧化氮(iNOS-NO)系統(tǒng)，其合成的NO是一種重要的抗心肌纖維化因子[1]。他汀類(lèi)藥物對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的CFs的iNOS-NO 系統(tǒng)活性是否有調(diào)控作用?尚未見(jiàn)報(bào)道。本文實(shí)驗(yàn)觀察了洛伐他汀干預(yù)條件下大鼠CFs的iNOS-NO 系統(tǒng)活性的變化，為心肌纖維化的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:出生2～3 d的清潔級(jí)SD大鼠18只，雌性10只，雄性8只，河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)804010。

1.1.2 試劑:洛伐他汀、醛固酮、四氮唑鹽(MTT)和胰蛋白酶(Sigma 公司);DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司);NO 和iNOS測(cè)定試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFs的培養(yǎng)和鑒定:在無(wú)菌條件下取大鼠的心室，采用胰蛋白酶消化法和差速貼壁法分離CFs。待CFs 生長(zhǎng)接近匯合時(shí)以1∶3 傳代。對(duì)CFs 進(jìn)行SABC 法免疫組織化學(xué)染色波形蛋白、纖維連接蛋白染色陽(yáng)性和平滑肌肌動(dòng)蛋白染色陰性鑒定為所需的CFs，純度達(dá)98%。實(shí)驗(yàn)用2～3代細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:分為對(duì)照組、不同濃度的洛伐他汀組(1×10－5、1×10－6、1×10－7和1×10－8)和醛固酮(1×10－7mol/L)組，細(xì)胞取自同批培養(yǎng)的CFs。

1.2.3 MTT 比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖:將對(duì)數(shù)增殖期CFs 接種在96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，在3℃、50 ml/L CO2及飽和濕度下培養(yǎng);24 h后換含1%血清DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h，使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)靜止期。棄上清液，分別加入各種干擾因素繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入MTT(5 g/L)20 μL，在酶標(biāo)儀上490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A490值)。

1.2.4 iNOS-NO 系統(tǒng)活性測(cè)定:

1)細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量和iNOS的活力測(cè)定:CFs 培養(yǎng)至近匯合狀態(tài)時(shí)，1%血清DMEM 培養(yǎng)液馴化24 h，分別加入培養(yǎng)液和藥物，孵育24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。采用硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO含量，采用分光光度計(jì)法測(cè)定iNOS 活性。

2)Western blot 分析iNOS 蛋白表達(dá):將2～3代的CFs種植于50 mL 培養(yǎng)瓶中增殖至亞匯合狀態(tài)后，在含1%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的洛伐他汀作用24 h后觀察iNOS 蛋白表達(dá)。用SDS 緩沖液溶解并粉碎細(xì)胞，95℃加熱5 min 使蛋白質(zhì)變性，離心取蛋白質(zhì)上清液20 μL。用10% SDS 聚丙烯酰胺電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(100 V，1.5 h)。5%脫脂奶粉4℃過(guò)夜封閉非特異結(jié)合部位，兔抗大鼠iNOS 多克隆抗體(1∶100)室溫孵育2 h，HRP 連接的二抗(1∶2 000)孵育2 h，DAB 顯色。采用Gel-pro 凝膠分析軟件成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western 印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析，吸光度值以積分光密度值(A)表示。

2 結(jié)果

2.1 洛伐他汀對(duì)CFs增殖的影響:在1×10－7、1×10－6和1×10－5mol/L洛伐他汀的作用下，A值分別為0.356±0.011、0.287±0.008 和0.231±0.007，隨著洛伐他汀濃度的增加呈遞減趨勢(shì)。1×10－8mol/L 洛伐他汀組的A490值與1×10－7mol/L 醛固酮組A490值比較差異無(wú)顯著性。

2.2 洛伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)CFs的NO含量和iNOS 活性的影響:以1×10－7mol/L 醛固酮誘導(dǎo)CFs 24 h 為對(duì)照組，(1×10－8－1×10－5)mol/L 洛伐他汀劑量依賴性增加CFs的NO含量和iNOS 活性(P＜0.01)(表1)。

表1 不同濃度洛伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)CFs的NO含量和iNOS 活性的影響Table1 Effects of various concentration of lovastatin on NO contents and iNOS activity of CFs induced by aldosterone (n=6)

2.3 洛伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)CFs iNOS 蛋白表達(dá)的影響:以空白對(duì)照組的吸光度掃描結(jié)果為100，1×10－7mol/L 醛固酮組吸光度掃描結(jié)果為33.37±4.14，洛伐他汀組吸光度掃描結(jié)果分別為52.73±4.04(1×10－8mol/L)，80.87±3.50(1×10－7mol/L)，121.13±6.90(1×10－6mol/L)，176.47±6.50 (1×10－5mol/L)。在1×10－8～1×10－5mol/L濃度范圍內(nèi)，洛伐他汀劑量依賴性地升高CFs的iNOS 蛋白表達(dá)(圖1)。

2.4 相關(guān)性分析:(1×10－8～1×10－5)mol/L 洛伐他汀和1×10－7mol/L醛固酮共同作用CFs 24 h后，CFs的NO 生成量與iNOS 活性、iNOS 活性與iNOS 蛋白表達(dá)均呈顯著正相關(guān)，r分別為0.826、0.896，P＜0.01。NO 生成量與A490值成顯著負(fù)相關(guān)(r= －0.908，P＜0.01)。

圖1 洛伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)CFs iNOS 蛋白表達(dá)的影響Fig1 Western blot analysis of Lovastatin on iNOS protein expression in CFs induced by aldosterone

3 討論

CFs增殖和膠原合成積聚過(guò)多是心肌纖維化的主要病理基礎(chǔ)。CFs 合成的NO是一種重要的抗心肌纖維化因子，可通過(guò)自分泌和(或)旁分泌的途徑抑制CFs增生和膠原合成，NO 能夠降低體外培養(yǎng)CFs 纖維連接蛋白，I型和III型膠原蛋白mRNA表達(dá)和纖維連接蛋白合成，延緩心肌纖維化發(fā)展[2]。本研究表明CFs 具有內(nèi)源性iNOS-NO 系統(tǒng)，能夠生成NO，與參考文獻(xiàn)[1]研究結(jié)果一致。

他汀類(lèi)藥物的非降脂作用日益受到矚目，除良好的調(diào)節(jié)脂代謝作用以外，他汀類(lèi)藥物尚具有改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，穩(wěn)定斑塊，減少心肌梗死和腦卒中等心腦血管事件的發(fā)生。最近有研究表明，瑞舒伐他汀能減緩并抑制狗的心肌肥厚，改善左室功能[3]。本研究已證實(shí)他汀類(lèi)藥物可抑制醛固酮促CFs增殖的作用，在1×10－8～1×10－5mol/L濃度范圍內(nèi)，洛伐他汀可抑制醛固酮作用增加CFs的NO含量、iNOS 活性、iNOS 蛋白表達(dá)。

醛固酮下調(diào)CFs的iNOS-NO 系統(tǒng)活性致CFs增殖，而洛伐他汀上調(diào)醛固酮誘導(dǎo)的CFs的iNOS-NO 系統(tǒng)的活性，拮抗醛固酮的促心肌纖維化作用。CFs的iNOS-NO 系統(tǒng)活性的變化參與了他汀類(lèi)藥物抑制醛固酮促心肌纖維化作用。

[1]Gustafsson AB，Brunton LL.Beta-adrenergic stimulation of rat cardiac fibroblasts enhances induction of nitric-oxide synthase by interleukin-1beta via message stabilization[J].Mol Pharmacol，2000，58:1470-1478.

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