周 煒，劉 瑋，廖 華，陳曼華

(武漢市中心醫(yī)院1.心內科;2.中心實驗室;3.老年科，湖北 武漢430014)

生理濃度的睪酮具有抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作用[1]，但其分子機制尚不清楚。巨噬細胞遷入內膜下吞噬脂質轉變?yōu)榕菽毎茿S 早期的標志性事件。本文旨在觀察睪酮對泡沫細胞形成的作用，以及對相關蛋白表達的影響，探討睪酮抗AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料:小鼠巨噬細胞系RAW264.7(中科院上海細胞生物所);氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(尚善生物);細胞膽固醇檢測試劑盒(普利萊公司);蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司);睪酮、油紅O(Sigma 公司);抗線粒體融合素2(Mfn2)抗體(Abcam 公司)，抗CD36，ATP 結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)及β-actin 抗體，辣根過氧化物酶標記的IgG(CST)。

1.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組:細胞接種于培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分組如下:對照組(control)不加干預因素;泡沫細胞組(Foam cells)加入50 μg/mL ox-LDL 孵育48 h;不同濃度睪酮組(Testosterone，T):分別加入5×10－9、5×10－8及5×10－7mol/L 睪酮預處理24 h，PBS 緩沖液洗脫，后續(xù)步驟同泡沫細胞組。

1.3 油紅O 染色:按參考文獻[2]的方法操作。

1.4 細胞膽固醇測定:按試劑盒說明操作，檢測細胞內膽固醇濃度，分別與蛋白濃度做出比值后，比較組間相對膽固醇濃度。包括總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯(總膽固醇－游離膽固醇)。

1.5 免疫印跡法檢測蛋白表達:按參考文獻[2]的方法操作，檢測目的蛋白/β-actin 吸光度比值。

2 結果

2.1 細胞內脂質含量:巨噬細胞與ox-LDL 孵育后，胞質內見大量紅色脂滴，細胞內膽固醇含量增加(P＜0.05)。預先行睪酮干預后，細胞內脂滴含量減少，膽固醇含量降低(P＜0.05)(圖1)。

2.2 目的蛋白的表達:與對照組比較，ox-LDL 刺激下巨噬細胞內Mfn2表達降低，CD36和ABCA1表達增高(P＜0.05);與泡沫細胞組比較，預先行睪酮干預后，Mfn2表達增加，CD36表達降低，ABCA1表達增高(P＜0.05)，呈一定濃度依賴性(圖2)。

圖1 睪酮對細胞膽固醇含量的影響Fig1 Effects of testosterone on the cholesterol in cells(±s，n=3)

圖2 睪酮對蛋白表達的影響Fig2 Effects of testosterone on the protein expression in cells (±s，n=3)

3 討論

本研究中，ox-LDL 刺激下巨噬細胞泡沫化，清道夫受體CD36和膽固醇外排蛋白ABCA1表達均增加。其中，ABCA1表達增加可能反映細胞對脂質負載的自身調節(jié)，提示在ox-LDL 誘導下巨噬細胞攝取及逆向轉運脂質均增加，而脂質攝取增多大于外排的作用，從而轉變?yōu)榕菽毎?。而預先給予不同濃度睪酮干預可呈濃度依賴性減少膽固醇在巨噬細胞內的蓄積，抑制其向泡沫細胞轉化，同時CD36表達降低，ABCA1表達增加。據(jù)此認為，睪酮可抑制巨噬細胞轉化為泡沫細胞，其作用與下調CD36 減少膽固醇攝取和上調ABCA1 增加膽固醇外排有關。

Mfn2是一種線粒體外膜蛋白，對線粒體融合、線粒體形態(tài)及功能的調節(jié)有重要作用，Mfn2 也是細胞信號傳導通路中一個重要的調控點[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2是原癌基因ras的直接負調控因子，可抑制磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B 和絲裂原活化蛋白激酶信號通路，抑制清道夫受體CD36，促進ABCA1表達，抑制巨噬細胞轉化為泡沫細胞[3]。這表明Mfn2是調控泡沫細胞形成及AS 發(fā)生與發(fā)展的重要基因，但對于Mfn2的上游調節(jié)方式尚無報道。本實驗中發(fā)現(xiàn)，睪酮呈濃度依賴性上調Mfn2表達。這提示睪酮作為內源性生物活性物質，可能通過上調Mfn2表達，影響下游膽固醇轉運相關蛋白CD36和ABCA1的表達，進而調節(jié)巨噬細胞對膽固醇的攝取和外排，從而發(fā)揮其抑制泡沫細胞形成的作用。

[1]Kelly DM，Jones TH.Testosterone:a vascular hormone in health and disease[J].J Endocrinol.2013，217:47-71.

[2]Liu C，Ge B，He C，et al.Mitofusin 2 decreases intracellular lipids in macrophages by regulating peroxisome proliferator-activated receptor-γ[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，450:500-506.

[3]Chen KH，Dasgupta A，Ding J，et al.Role of mitofusin 2(Mfn2)in controlling cellular proliferation[J].FASEB J.2014，28:382-394.