張艷杰　李桂玲　王金水等

摘要：研究重金屬離子Cr（Ⅵ）在不同濃度下對(duì)小麥種子萌發(fā)及其幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：Cr（Ⅵ）對(duì)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)影響的臨界值為18 mg/L，即濃度低于18 mg/L的Cr（Ⅵ）促進(jìn)小麥種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，高于 18 mg/L則抑制小麥種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)；Cr（Ⅵ）對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用大于對(duì)芽生長(zhǎng)的抑制作用；高濃度的 Cr（Ⅵ） 對(duì)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制是通過抑制淀粉酶的活性來實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：Cr（Ⅵ）；小麥種子；萌發(fā)；淀粉酶；同工酶

中圖分類號(hào)： Q946.5；Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0073-03

鉻（chromium，Cr）是自然環(huán)境中存在的1種重金屬元素，同時(shí)也是1種重要的環(huán)境污染物，被列為工業(yè)“五毒”之一。鉻在自然界中主要以三價(jià)鉻（Cr3+）、六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]的化合物形式存在，且后者的毒性比前者更強(qiáng)[1-2]。已有研究證明，Cr（Ⅵ）不是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素，在植物體內(nèi)過量積累對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的抑制作用[3]。近年來，隨著印染、電鍍、化工、電子等行業(yè)的發(fā)展，越來越多的含鉻廢水、廢渣被排放到水體中，導(dǎo)致農(nóng)田灌溉用水污染嚴(yán)重，進(jìn)而對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育造成了巨大傷害，這不僅降低了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且能夠通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康[4]。

小麥（Triticum aestivum Linn.）是我國(guó)重要的糧食作物，對(duì)于小麥的研究具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義，其產(chǎn)量和品質(zhì)也越來越受到關(guān)注[5]。有關(guān)調(diào)查顯示，受重金屬污染的農(nóng)田耕地面積占總耕地面積的1/5，其中受鉻污染的尤為嚴(yán)重[6]，因此研究鉻污染對(duì)小麥種子生長(zhǎng)發(fā)育的影響極其重要。

目前，關(guān)于Cr（Ⅵ）鹽對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究多數(shù)是集中在對(duì)萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)階段形態(tài)學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)分析方面，而關(guān)于Cr（Ⅵ）鹽對(duì)小麥不同發(fā)育階段形態(tài)指標(biāo)的影響是如何實(shí)現(xiàn)的研究則鮮有報(bào)道。本研究圍繞這一問題，以小麥為試驗(yàn)材料，采用室內(nèi)水培法對(duì)小麥?zhǔn)┮圆煌瑵舛忍荻鹊腃r（Ⅵ）溶液，研究Cr（Ⅵ）鹽對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)期間關(guān)鍵酶——淀粉酶活性的影響，以期為重金屬Cr（Ⅵ）對(duì)小麥生長(zhǎng)毒害機(jī)理的研究，以及耐、抗重金屬Cr（Ⅵ）鹽品種的選育提供理論支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥選用溫麥6號(hào)，產(chǎn)自河南省黃泛區(qū)農(nóng)場(chǎng)。試劑為華美生物工程公司生產(chǎn)的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 挑選大小均一、籽粒飽滿的溫麥6號(hào)種子，先用5%H2O2處理5 min進(jìn)行表面消毒，然后用蒸餾水沖洗3～5遍，再加蒸餾水沒過種子最上層2 cm左右，浸種12 h。將小麥種子腹溝向下排列在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿40粒，使每粒種子間留有均勻的間距，以防發(fā)霉種子對(duì)健康種子的感染。在培養(yǎng)皿中分別加入5 mL不同梯度濃度（3、5、10、15、18、20、25、30 mg/L，以Cr（Ⅵ）計(jì)）的K2Cr2O7溶液；對(duì)照（CK）用蒸餾水培養(yǎng)，每個(gè)濃度梯度均設(shè)置6個(gè)重復(fù)，置于室溫、自然光照下培養(yǎng)萌發(fā)，處理時(shí)間分別為3、7 d。所設(shè)的6個(gè)重復(fù)中3個(gè)重復(fù)用于培養(yǎng)3 d的形態(tài)學(xué)和生理指標(biāo)測(cè)定；另外3個(gè)重復(fù)用于培養(yǎng)7 d的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 測(cè)定培養(yǎng)3、7 d小麥的芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)。記錄的數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行成組數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 生理學(xué)指標(biāo)測(cè)定 待種子培養(yǎng)3、7 d后，分別去掉種皮，稱取0.5 g置于預(yù)冷的研缽中，加入少量石英砂和2 mL蒸餾水，研磨勻漿后轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，用蒸餾水定容至10 mL，4 ℃、10 000 r/min條件離心15 min，上清液即為粗酶液。取上清液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）測(cè)定萌發(fā)種子淀粉酶同功酶活性，分離膠濃度為7.2%，濃縮膠濃度為3.2%[7]。于日光燈下觀察記錄酶譜，用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。須要測(cè)量的數(shù)據(jù)有脫色前后膠長(zhǎng)、指示劑游動(dòng)距離、酶帶長(zhǎng)。計(jì)算遷移率相關(guān)公式為V=mE。式中：V為溶液中帶電粒子的移動(dòng)速度，cm/s；m為粒子的有效遷移率，cm3/（V·s）；E為電場(chǎng)，V/m。同時(shí)，采用分光光度法（3，5-二硝基水楊酸法）測(cè)定萌發(fā)種子的α-淀粉酶同工酶活性[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr（Ⅵ）溶液對(duì)小麥主要形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

2.1.1 Cr（Ⅵ）溶液對(duì)小麥胚芽的影響 如圖1所示，用不同濃度梯度Cr（Ⅵ）鹽處理后，萌發(fā)3 d的小麥胚芽芽長(zhǎng)在低濃度處理時(shí)略高于對(duì)照；相反，在高濃度處理時(shí)比對(duì)照低。與對(duì)照相比，Cr（Ⅵ） 處理濃度為3～15 mg/L時(shí)，可以刺激小麥胚芽的生長(zhǎng)，對(duì)小麥胚芽生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用，其中處理濃度在 10 mg/L 時(shí)對(duì)小麥胚芽的生長(zhǎng)有極顯著的促進(jìn)作用；當(dāng) Cr（Ⅵ） 處理濃度提高至18 mg/L時(shí)，小麥胚芽的長(zhǎng)度開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，芽長(zhǎng)與對(duì)照基本相同；處理濃度為20 mg/L時(shí)，小麥種子胚芽的生長(zhǎng)受到了極顯著的抑制；隨著Cr（Ⅵ）鹽濃度的繼續(xù)升高，受抑制程度更為嚴(yán)重，結(jié)果見表1。處理7 d的小麥胚芽生長(zhǎng)規(guī)律與處理3 d的小麥胚芽生長(zhǎng)規(guī)律總體趨勢(shì)表現(xiàn)一致，結(jié)果如圖2所示。因此推測(cè)，18 mg/L的Cr（Ⅵ）處理濃度為影響小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的臨界值。

2.1.2 Cr（Ⅵ）溶液對(duì)小麥胚根的影響 用不同濃度梯度的Cr（Ⅵ）處理后，與對(duì)照相比，對(duì)萌發(fā)3、7 d的小麥胚根的生長(zhǎng)均有抑制作用，且均達(dá)到了極顯著水平，結(jié)果見圖1、圖2、表1。這說明用不同濃度Cr（Ⅵ）處理后，小麥胚根的生長(zhǎng)狀況與胚芽不同；高濃度（>18 mg/L）的Cr（Ⅵ）處理時(shí)，Cr（Ⅵ）濃度越高，抑制效應(yīng)越強(qiáng)，且對(duì)小麥種子胚根生長(zhǎng)的抑制作用大于胚芽。

2.2 Cr（Ⅵ）溶液對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育過程中關(guān)鍵酶淀粉酶活性的影響

2.2.1 Cr（Ⅵ）溶液對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)過程中淀粉酶同工酶活性的影響 如圖3所示，不同濃度Cr（Ⅵ）處理7 d 的小麥總淀粉酶同功酶譜帶共有6條，依次標(biāo)為a、b、c、d、e、f。與對(duì)照相比，Cr（Ⅵ）處理濃度為3～15 mg/L時(shí)，6條同工酶的譜帶寬度和亮度均高于對(duì)照，且在10 mg/L時(shí)的譜帶最寬、亮度最強(qiáng)；Cr（Ⅵ）處理濃度為18 mg/L時(shí)，6條同工酶譜帶寬度、亮度基本和對(duì)照相同；Cr（Ⅵ）處理濃度為20～30 mg/L時(shí)，a、d、e、f 4條同工酶的表達(dá)均受到不同程度的抑制，尤其是處理濃度達(dá)到 30 mg/L 時(shí)，a、b 2條譜帶消失，d、e、f 3條同工酶譜帶明顯變淺、變窄。結(jié)果表明，隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，小麥幼苗生長(zhǎng)過程中淀粉酶同工酶的活性與表達(dá)呈現(xiàn)先增后降特征；總體變化趨勢(shì)與Cr（Ⅵ）處理后小麥種子胚芽的生長(zhǎng)規(guī)律基本一致，其中高濃度Cr（Ⅵ）（>18mg/L）處理時(shí)對(duì)淀粉酶同工酶的抑制作用同于對(duì)胚根的抑制作用?？傮w結(jié)果說明，Cr（Ⅵ）處理對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育的影響可能是通過影響淀粉酶活性來實(shí)現(xiàn)的。

2.2.2 Cr（Ⅵ）溶液對(duì)小麥α-淀粉酶活性的影響 α-淀粉酶是植物種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的重要酶，因此其活性的高低與種子活力大小、種子是否能夠萌發(fā)密切相關(guān)。如圖4所示，Cr（Ⅵ）處理3、7 d的小麥α-淀粉酶活性變化趨勢(shì)基本一致，都隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高呈先升后降趨勢(shì)，且活性都在 15 mg/L Cr（Ⅵ） 處理時(shí)達(dá)到最大值。與對(duì)照相比，Cr（Ⅵ）處理3 d 的小麥α-淀粉酶活性在Cr（Ⅵ）處理濃度為30 mg/L時(shí)受到抑制，處理濃度為3～25 mg/L均提高了α-淀粉酶活性；Cr（Ⅵ）處理7 d后，小麥幼苗的α-淀粉酶活性在25 mg/L時(shí)開始受到抑制，此后繼續(xù)升高Cr（Ⅵ）處理濃度，α-淀粉酶活性受到更強(qiáng)抑制。這與小麥胚芽生長(zhǎng)的受抑制濃度略有差異，但與培養(yǎng)7 d的淀粉酶同工酶垂直電泳檢測(cè)結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度Cr（Ⅵ）處理對(duì)小麥種子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，Cr（Ⅵ）濃度低于18 mg/L時(shí)，小麥胚芽的芽長(zhǎng)以及淀粉酶同工酶活性與對(duì)照相比均有所提高；Cr（Ⅵ）濃度高于18 mg/L時(shí)，小麥苗芽與淀粉酶同工酶活性都受到了抑制，且隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，抑制作用更強(qiáng)。因此可以認(rèn)為，18 mg/L為臨界值，總體表現(xiàn)出“低促高抑”特點(diǎn)。這與李桂玲等在研究Cr3+處理對(duì)小麥種子幼苗的影響以及黃輝等研究Cr（Ⅵ）處理玉米幼苗中得到的結(jié)果一致[9-10]。此外，高濃度Cr（Ⅵ）處理時(shí)，小麥種子胚根生長(zhǎng)的受抑制程度大于胚芽[11]，且對(duì)小麥同種器官在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段抑制作用不同，后期抑制程度更大。原因可能是種子胚根部位最先突破種皮暴露在Cr（Ⅵ）溶液中，隨著胚根受Cr（Ⅵ）脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，積累量越多，因此從宏觀上表現(xiàn)出受到更嚴(yán)重的傷害。

植物種子萌發(fā)需要足夠的物質(zhì)和能量來源，小麥等禾谷類植物種子的主要貯藏物質(zhì)是淀粉，通過淀粉酶水解淀粉獲得能源物質(zhì)進(jìn)而完成種子的萌發(fā)，這個(gè)過程中淀粉酶活性至關(guān)重要[12-13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度（3～15 mg/L） Cr（Ⅵ） 處理時(shí)，萌發(fā)7 d的小麥淀粉酶同工酶活性逐漸升高，使得淀粉的水解速度加快從而促進(jìn)小麥種子胚芽的生長(zhǎng)；當(dāng)Cr（Ⅵ）鹽濃度大于18 mg/L時(shí)，淀粉酶同工酶活性開始降低，相應(yīng)的小麥種子胚芽的生長(zhǎng)受到了抑制，芽長(zhǎng)均低于對(duì)照；高濃度Cr（Ⅵ）處理時(shí)，小麥α-淀粉酶活性也受到了不同程度的抑制，表現(xiàn)為小麥胚根胚芽的生長(zhǎng)受到抑制。有學(xué)者研究了小麥和水稻種子萌發(fā)階段同工酶的表達(dá)，結(jié)果證明淀粉酶活性變化趨勢(shì)反映了實(shí)生苗的形態(tài)學(xué)變化[14-15]。因此，Cr（Ⅵ） 鹽對(duì)小麥種子萌發(fā)的影響可能是通過影響小麥種子中淀粉酶活性來實(shí)現(xiàn)的，但是關(guān)于Cr（Ⅵ）鹽如何作用于淀粉酶活性部位，以及高濃度Cr（Ⅵ）鹽如何引起淀粉酶活性下降等問題的分子機(jī)理值得進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Becquer T，Quantin C，Sicot M，et al. Chromium availability inultramafic soils from New Caledonia[J]. Science of the Total Environment，2003，301（1/2/3）：251-261.

[2]張義賢. 三價(jià)鉻和六價(jià)鉻對(duì)大麥毒害效應(yīng)的比較[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1997，17（6）：565-568.

[3]Shanker A K，Cervantes C，Loza-Tavera H，et al. Chromium toxicity in plants[J]. Environment International，2005，31（5）：739-753.

[4]李 天，來航線，和文祥，等. Cr（Ⅵ）的土壤酶效應(yīng)研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，40（8）：171-178.

[5]馬鴻翔，王龍俊，姚金保，等. 江蘇小麥品質(zhì)現(xiàn)狀與提升策略[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（3）：468-473.

[6]宋 波，高 定，陳同斌，等. 北京市菜地土壤和蔬菜鉻含量及其健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（10）：1707-1715.

[7]李 勤. 谷物萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較[J]. 廣西輕工業(yè)，2007，23（5）：9-10.

[8]王學(xué)奎. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 2版. 北京：高等教育出版社，2006：174-176.

[9]李桂玲，李明澤，李歡慶，等. Cr3+對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（4）：115-116.

[10]黃 輝，高 峽，王 娟. 六價(jià)鉻對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)及抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（4）：633-638.

[11]李麗君，鄭普山，周懷平，等. 鉻對(duì)玉米種子萌發(fā)的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，29（2）：32-34.

[12]陳禪友，劉 磊. 長(zhǎng)豇豆種子萌發(fā)進(jìn)程中生理生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化[J]. 種子，2006，25（9）：30-33.

[13]何俊瑜，任艷芳. 鎘脅迫對(duì)水稻種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和淀粉酶活性的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（增刊1）：131-134.

[14]Umemura T，Perata P，F(xiàn)utsuhara Y，et al. Sugar sensing and alpha-amylase gene repression in rice embryos[J]. Planta，1998，204（4）：420-428.

[15]Cejudo F J，Cubo M T，Baulcombe D C. Amyl expression during wheat seed germination[J]. Plant Science，1995，106（2）：207-213.