董貴軍，喬勇升，李興根，韓芷玲，胡慧，馮寅潔，陳偉（泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇泰州225300）

液質(zhì)聯(lián)用法測定植物油中的4種沒食子酸酯

董貴軍，喬勇升*，李興根，韓芷玲，胡慧，馮寅潔，陳偉
（泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇泰州225300）

摘要：建立了食用植物油中沒食子酸酯類化合物測定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品經(jīng)正己烷飽和的乙睛萃取后，采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱分離，以0.1%甲酸水和甲醇為流動相梯度洗脫，電噴霧電離負離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行定性、定量檢測。4種沒食子酸酯類化合物的檢出限（S/N=3）為0.02 mg/kg～0.05 mg/kg，定量限（S/N=10）為0.06 mg/kg～0.15 mg/kg；在0.20、0.50、0.80 mg/kg 3個加標水平下回收率為75.4%～91.3%，相對標準偏差小于9.2%。應(yīng)用建立的方法對市售食用植物油產(chǎn)品進行測定，未發(fā)現(xiàn)4種沒食子酸酯類化合物。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；沒食子酸酯類化合物；食用植物油；沒食子酸丙酯；沒食子酸異戊酯；沒食子酸辛酯；沒食子酸月桂酯

沒食子酸（gallic acid，GA），化學(xué)名3，4，5-三羥基苯甲酸，是可水解鞣質(zhì)的組成部分，廣泛存在于葡萄，茶葉等植物中，是自然界存在的一種多酚類化合物[1]。以沒食子酸為原料可以人工合成沒食子酸酯類化合物，其脂溶性顯著增強，且沒食子酸酯類化合物分子中有3個酚羥基處于鄰位，是質(zhì)子的供體，表現(xiàn)出活潑的還原性，具有良好的抗氧化活性[2]和抑菌性能[3]。沒食子酸酯類化合物的烷基酯根據(jù)烷基碳原子個數(shù)可分為低級酯（如甲酯、乙酯、丙酯等）和高級酯（如辛酯、月桂酯等），其中沒食子酸丙酯是（Propyl gallate，簡稱PG）常作為抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)。雖然沒食子酸丙酯的毒性被認為低于丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）與特丁基對苯二酚（TBHQ）[4]，但仍有報道稱沒食子酸酯這類人工合成抗氧化劑的過量使用仍會對人體健康造成危害，如過敏性炎癥[5]等。

人工合成食品添加劑的使用安全性越來越受到關(guān)注，對其使用量也有嚴格的規(guī)定。我國的食品添加劑使用標準GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[6]規(guī)定沒食子酸丙酯在脂肪和油、熟制堅果與籽類、油炸和方便米面制品、餅干、腌臘肉制品類、干制水產(chǎn)品、雞肉粉和膨化食品中的最大使用量不得超過0.1 g/kg、膠基糖果中不得超過0.4 g/kg。而沒食子酸異戊酯（Isoamyl Gallate，簡稱IAG）、沒食子酸辛酯（Octyl gallate，簡稱OG）、沒食子酸月桂酯（Dodecyl gallate，簡稱DG）未被GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》確認為允許使用的食品添加劑品種。

沒食子酸酯類化合物檢測常用的方法有分光光度計法[7]、液相色譜法[8-11]、毛細管電泳法[12]。國家標準主要采用分光光度計法[13]和液相色譜法[14-15]對PG進行檢測。本文建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜法對食用植物油中沒食子酸酯類化合物進行定性定量分析的檢測方法，快速簡便，準確靈敏，為沒食子酸酯類化合物的檢測提供了有利工具。

1　試驗部分

1.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Waters Micromass Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀、Mass-Lynx V4.1數(shù)據(jù)處理操作平臺：美國Waters公司；Millipore純水系統(tǒng)，配有Milli-Q Academic超純水器和RiOs反滲透水純化系統(tǒng)：美國Millipore公司；Sartorius CP225D型電子分析天平，感量為0.000 01 g：德國Sartorius公司。

G（純度≥99.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；IAG（純度≥98.5%）、OG（純度≥98.5%）：東京化成工業(yè)株式會社；DG（純度≥99.0%）：美國Fluka公司；乙腈、甲醇、正己烷（HPLC級）：迪馬科技有限公司；甲酸（分析純）：國藥集團藥業(yè)股份有限公司；試驗用水均為超純水：Millipore公司超純水系統(tǒng)制備，電阻率為18.2 MΩ·cm；Acrodisc GHP雙性濾膜（0.2 μm）：美國PALL公司；氮氣、氦氣（純度>99.999%）：南京特種氣體廠有限公司。

沒食子酸酯標準溶液：各自稱取沒食子酸酯標準品適量，用少量甲醇溶解，并用甲醇定容至50 mL，配成1.0 g/L的標準儲備溶液，置于4℃冰箱避光保存。使用時根據(jù)需要用空白樣品提取液配制成適當質(zhì)量濃度的標準溶液。

1.2儀器工作條件

液相色譜條件：WatersACQUITYUPLCHSST3色譜柱（2.1mm×50 mm，1.7μm）；柱溫30℃；流量0.3mL/min；進樣量10 μL；流動相A為0.1%（體積分數(shù)，下同）甲酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0 min～1.0 min，B 為28%；1.0 min～1.4min，B由28%升至70%；1.4 min～1.9 min，B由70%升至90%；保持0.9 min；2.8 min～2.9 min，B由90%降至28%；保持1 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧負離子源ESI（-），離子源溫度120℃，毛細管電壓3.0 kV，RF透鏡電壓0.5 V，脫溶劑溫度300℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔氣流量50 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），其他參數(shù)見表1。

表1　4種沒食子酸酯的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1　UPLC-MS/MS acquisition parameters for the 4 gallates

1.3試驗方法

準確稱取植物油樣品2 g（精確至0.000 1 g）于具塞離心管中，加人5 mL乙睛飽和的正己烷，漩渦混合3 min～5 min以充分溶解油樣，加人10 mL正己烷飽和的乙睛，漩渦混合3 min～5 min，靜置分層，用膠頭吸管將乙睛層轉(zhuǎn)人濃縮瓶內(nèi)。重復(fù)以上操作再用乙睛提取兩次，合并乙睛提取液于錐形瓶內(nèi)。將乙睛提取液在40℃下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，初始流動相定容至2 mL，0.22 μm濾膜過濾后備用。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件

沒食子酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　沒食子酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Structure of gallates

如圖1所示，PG、IAG、OG、DG的分子結(jié)構(gòu)中都含有3個羥基，呈弱酸性，適合在ESI的負離子模式下形成準分子離子。以[M-H]-作為母離子，進行子離子掃描，確定豐度最高的兩個子離子作為定性、定量特征離子。對毛細管電壓、錐孔電壓、射頻透鏡電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，4種沒食子酸酯的定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

本文考察了4種沒食子酸酯在純水、甲醇、0.1%甲酸、氫氧化銨（pH8.0）4種溶液作為流動相時的電噴霧電離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PG、DG、OG、IAG在中性環(huán)境（純水、甲醇）和酸性環(huán)境（0.1%甲酸溶液）中均能電離、且信號良好，在堿性環(huán)境（氫氧化銨溶液）中信號最強。

2.2沒食子酸酯的碰撞誘導(dǎo)解離分析

如圖1所示，PG、IAG、OG、DG的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，其苯環(huán)上都含有3個羥基，在負離子模式下均失去1 個H離子生成[M-H]-。以[M-H]-為母離子進行碰撞誘導(dǎo)解離分析。4種沒食子酸酯都產(chǎn)生了m/z為124.1和169.1的碎片子離子。推測PG裂解途徑如圖2所示。

圖2沒食子酸丙酯（PG）可能的ESI-MS裂解途徑Fig.2　Proposed fragmentation pathways of propyl gallate in ESI-MS

IAG、OG、DG在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律很有可能與PG類似。

2.3色譜條件

由于4種沒食子酸酯的母離子 [M-H]-經(jīng)過碰撞誘導(dǎo)解離后產(chǎn)生的兩個豐度最高的子離子都為m/z 169.1和m/z124.1，為避免干擾，通過液相色譜將4種沒食子酸酯盡量分離。結(jié)合沒食子酸酯的理化性質(zhì)及其在色譜柱的分配特性，分別選用基于1.7 μm小顆粒填料技術(shù)的ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱和ACQUITY UPLC BHE C18色譜柱對沒食子酸酯進行色譜分離。結(jié)果顯示，優(yōu)化條件下4種沒食子酸酯在AC QUITY UPLC HSS T3色譜柱能獲得更好的色譜分離效果。

試驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-10 mmol/L甲酸銨溶液、甲醇-氫氧化銨（pH8.0）溶液4種流動相在液質(zhì)聯(lián)用檢測中的分離效果。結(jié)果表明，含有少量酸的流動相體系可以使沒食子酸酯在色譜柱上獲得理想的分離效果。綜合考慮沒食子酸酯在4種流動相體系中的色譜分離效果和質(zhì)譜檢測情況，選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為沒食子酸酯液質(zhì)聯(lián)用檢測的流動相。

2.4工作曲線和檢出限

按本試驗方法，對50、100、200、500、1 000 μg/L沒食子酸酯混合標準溶液進行測定。以定量離子色譜峰峰面積為縱坐標，沒食子酸酯的質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制工作曲線。采用在空白油脂樣品中添加沒食子酸酯標準品的方法，設(shè)定目標物質(zhì)定量離子色譜峰的檢出限（LOD）為S/N=3，定量限（LQD）為S/N=10。4種沒食子酸酯的線性方程、檢出限和定量限見表2。

表2　4種沒食子酸酯的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R）2、檢出限和定量限Table 2　Linear range，regression equation，correlation coefficient （R2），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the 4 gallates

2.5回收率與精密度

為檢驗方法的真實度，采用經(jīng)測定不含沒食子酸酯的花生油樣品作為空白基質(zhì)進行添加回收率和精密度試驗，樣品添加標準溶液使沒食子酸酯的含量分別為0.20、0.50、0.80 mg/kg，按照1.3制備方法進行處理，1.2儀器條件進行測定，重復(fù)測試6次，回收率及精密度結(jié)果見表3。

表3　花生油中4種沒食子酸酯的添加回收率和精密度測試結(jié)果（n=6）Table 3　Results of recovery and precision for 4 gallates in peanut oil（n=6）

在做標準添加時，由于甲醇配制的標準儲備液與油脂樣品不能完全混溶，可使用丙酮稀釋標準儲備液配制成標準工作液后進行添加?？瞻讟悠分刑砑記]食子酸酯（0.50 mg/kg）獲得的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖3。

圖3　空白油脂樣品及加標油脂樣品的總離子流色譜圖Fig.3　Total ion current chromatograms of a blank oil sample and an oil sample spiked with 0.50 mg/kg of the standard

2.6樣品測定

為驗證該方法的可靠性，從超市購買了10種食用植物油產(chǎn)品（包括大豆油、花生油、菜籽油、葵花籽油、玉米油）進行測定，同時作質(zhì)控樣品。結(jié)果顯示，所抽取的樣品中均未檢出沒食子酸酯殘留，質(zhì)控樣品的回收率等指標均達到分析要求。

3　結(jié)論

建立了一種使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定食用植物油中4種沒食子酸酯的方法。該方法快速簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為食用植物油中沒食子酸酯的定性與定量分析提供了實用的技術(shù)手段。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.039

收稿日期：2014-04-18

作者簡介：董貴軍（1984—），男（漢），助理工程師，本科，研究方向：食品安全檢測。

*通信作者：喬勇升（1980—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測。

Determination of Gallates in Vegetable Oil by UPLC-MS/MS

DONG Gui-jun，QIAO Yong-sheng*，LI Xing-gen，HAN Zhi-ling，HU Hui，F(xiàn)ENG Yin-jie，CHEN Wei
（Taizhou Institute of Supervision&Testing on Product Quality，Taizhou 225300，Jiangsu，China）

Abstract：A method was established for the determination of gallates in edible vegetable oil based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The oil sample was extracted by hexane-saturated acetonitrile，and the chromatographic separation was performed on an ACQUITY UPLCTM HSS T3 column（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）by gradient elution with 0.1%formic acid solution and methanol as the mobile phase.The analyte was detected by electrospray ionization in negative ion mode-MS/MS in multiple reaction monitoring（MRM）mode.For the four gallates，the limits of detection（LOD）were from 0.02 mg/kg to 0.05 mg/kg and the limits of quantification（LOQ）were from 0.06 mg/kg to 0.15 mg/kg.The average recoveries were ranged from 75.4%to 91.3%at the spiked levels of 0.20，0.50，0.80 mg/kg，with the relative standard deviations（RSDs）were not more than 9.2%.Some edible vegetable oil products from local market were detected by the developed method，and the four gallates were not found.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；gallates；edible vegetable oil；propyl gallate；isoamyl gallate；octyl gallate；dodecyl gallate