弓玉紅，田晶（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西離石033000）

納豆制備及冷凍干燥保護劑的篩選和優(yōu)化研究

弓玉紅，田晶
（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西離石033000）

摘要：從甘油、蔗糖、抗壞血酸、葡聚糖和檸檬酸鈉5種保護劑中，通過單因素試驗篩選出了甘油、抗壞血酸和檸檬酸鈉這3種對納豆菌和納豆激酶具有較好保護效果的保護劑，然后將這3種保護劑通過正交試驗選出一組效果較好的保護劑組合：甘油5%、抗壞血酸0.5%、檸檬酸鈉5%，在此條件下納豆激酶相對酶活可達1 171.569 IU/mL，納豆菌的存活可達9.5×108CFU/mL。

關(guān)鍵詞：納豆；冷凍干燥保護劑；篩選；優(yōu)化

納豆（natto）源于中國，是日本一種獨特的大豆傳統(tǒng)食品，類似中國的豆豉，它的制作簡單，風(fēng)味獨特，價格低廉[1]，納豆不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且含有多種生理活性物質(zhì)，如納豆激酶、納豆菌等，賦予納豆多種保健功能，如溶血栓、抗腫瘤、降血壓等作用，因此開發(fā)納豆食品，會帶來良好的經(jīng)濟效益和社會效益[2]。

冷凍干燥是目前保持蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)生物活性的一種有效的方法。但是，冷凍干燥過程中會造成細胞的損傷，及酶的損傷、變性。在冷凍干燥時加入適宜的保護劑，可以在很大程度上減輕或避免冷凍干燥對細胞及酶等生物大分子帶來的損傷。本研究主要是冷凍干燥過程中保護劑對納豆菌存活和納豆激酶酶活的影響進行研究。采用甘油、抗壞血酸、蔗糖、葡聚糖和檸檬酸鈉作為凍干保護劑，先進行單因素試驗，篩選效果較好的保護劑，再通過正交試驗優(yōu)化得到最佳保護劑組合。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

納豆菌（Bacillus natto H106）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室；蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%、瓊脂2%；尿激酶（1 280 IU/支）：中國藥物生物制品研究所；凝血酶、牛纖維蛋白原（1 000 IU/支）：Sigma公司；瓊脂糖、蔗糖（分析純）、甘油（食品級）、檸檬酸鈉（食品級）、抗壞血酸（分析純）、葡聚糖（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.2主要儀器

真空冷凍干燥試驗機（JDG-0.2）：蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；不銹鋼手提式壓力滅菌器（YWQ-LS-18S1）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-500型）：北京光明醫(yī)療儀器廠；超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫干燥箱（DFZ-05）：北京醫(yī)療機械廠；漩渦振蕩器：北京中西遠大科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：金壇市科析儀器有限公司；照相顯微鏡（BX51M）：Olympus。

1.3方法

1.3.1納豆菌的活化及培養(yǎng)

按蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%的比例配制液體培養(yǎng)基，在無菌條件下，挑取一環(huán)納豆菌接入液體培養(yǎng)基中，后在37℃的搖床上震蕩培養(yǎng)24 h，使菌液濃度達到108cfu/mL。納豆菌菌落及其菌體形態(tài)的觀察：將納豆菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其長出單個菌落，革蘭氏染色，用顯微鏡觀察。

1.3.2納豆的制備

洗凈大豆后用3倍的水量浸泡24 h，室溫15℃后瀝水。在121℃溫度下蒸煮大豆20 min，煮到易用手捏碎，冷卻備用。在無菌條件下，將接好種的液體培養(yǎng)基按3%的接種量噴灑于大豆表面，攪拌均勻，鋪成3 cm～5 cm的薄層，37℃培養(yǎng)24 h[3-5]。

1.3.3納豆激酶酶活的測定方法

納豆激酶酶活性的測定方法有纖維蛋白平板法、TAME底物法等多種方法，但目前較為常用的是纖維蛋白平板法，其原理是以凝血酶和纖維蛋白原制成人工血栓平板，注入納豆激酶，用溶圈面積的大小來表示納豆激酶的溶纖維活性的大小[6]。本試驗采用纖維蛋白平板法測定納豆激酶的酶活性。

1.3.3.1纖維蛋白平板的制作

參照Astrup[7]等報道的纖維蛋白平板法，試驗過程中需要臨時配制試劑，平板最好當(dāng)天使用。納豆激酶的酶活性以測得的纖維蛋白溶解圈的面積來表示。

1.3.3.2酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-9]

以相對于尿激酶的活力單位來表示納豆激酶活力的測定的。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同的濃度（100、150、200、250、300 IU/mL），在纖維蛋白平板上用打孔器打一系列直徑3 mm的孔，移液器各取10 μL不同濃度的尿激酶溶液注入孔中，靜置10 min，放入37℃恒溫培養(yǎng)18 h。分別測定纖維蛋白溶解圈的兩個相互垂直直徑，將其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積，并根據(jù)纖維蛋白溶解圈與尿激酶的活力單位的面積來制作酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線，以直徑乘積為橫坐標(biāo)，酶活為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

從繪制的圖中可以看出，尿激酶的酶活與其溶圈面積成線性關(guān)系，其方程為：y=224.8x-17.623，根據(jù)此線性方程，可以計算出納豆中納豆激酶的相對酶活。（y表示納豆激酶相對酶活，x表示溶圈的面積）

1.3.3.3納豆激酶酶活力的測定[10]

在無菌環(huán)境中稱取5 g納豆，加入10 mL無菌水，放入滅過菌的研缽中充分研磨30 min，用無菌紗布過濾。取濾液10 μL點樣于纖維蛋白平板上，37℃的恒溫培養(yǎng)18 h后，分別量取溶圈的兩個相互垂直直徑，其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積，數(shù)值代入酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出相當(dāng)?shù)哪蚣っ竼挝唬↖U/mL），即為納豆激酶的酶活力。

圖1 尿激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of urokinase activity

1.3.4納豆菌活菌數(shù)的測定

納豆菌的存活率采用稀釋平板計數(shù)法測定[11]。

1.3.4.1冷凍干燥前活菌數(shù)的測定

在無菌環(huán)境中稱取5 g納豆，加入10 mL無菌水，放入滅過菌的研缽中充分研磨30 min，用無菌紗布過濾。取得的濾液，用滅過菌的移液管取1mL濾液，進行梯度稀釋到10-7然后取0.5 mL稀釋液到裝有凝固的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，涂勻，放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，計數(shù)。

1.3.4.2凍干后活菌數(shù)的測定

在無菌條件下，稱取1.75 g干納豆，加入13.25 mL無菌水，在研缽中充分研磨30 min。然后按照1.2.4.1的操作進行培養(yǎng)、計數(shù)。

論文中納豆菌數(shù)均為0.5 mL樣品稀釋液時的活菌數(shù)（n），若換算成每克干納豆的納豆菌活菌數(shù)（107個/g）= n×2×（13.25+1.75）/1.75；納豆激酶酶活力均為相對尿激酶酶活力（m），若換算成每克干納豆的納豆激酶酶活（IU/g）=m×（13.25+1.75）/1.75。

1.3.5冷凍干燥保護劑的篩選和優(yōu)化

參照文獻報道[10，12]，采用甘油、抗壞血酸、蔗糖、葡聚糖和檸檬酸鈉為保護劑，通過單因素試驗和正交試驗確定最佳的復(fù)合保護劑組合。

1.3.5.1單因素試驗

把新鮮納豆放在-20℃冰箱中凍1 h，拿出在無菌環(huán)境中將甘油、蔗糖、抗壞血酸等保護劑按不同量加入，鋪成一層放入凍干機中，樣品以真空度為20 Pa～30 Pa、冷阱溫度為-45℃、加熱擱板溫度為40℃的條件下冷凍干燥12 h，4℃冷藏備用。測出凍干前后納豆菌的活菌數(shù)和納豆激酶的酶活力，由此篩選得到保護效果較好的凍干保護劑。

1.3.5.2正交試驗優(yōu)化保護劑組合

按不同比例復(fù)配篩選出的保護效果較好的保護劑進行正交試驗。

2　結(jié)果與分析

2.1納豆菌的形態(tài)特征

納豆菌的菌落及其菌體的形態(tài)特征如圖2所示。

圖2　納豆菌的菌落和菌體形態(tài)特征圖Fig.2　The colony and morphological characteristics graph of Bacillus natto

從圖2中可以看出，納豆菌菌落呈乳白色，圓形，表面粗糙且有皺褶，微突起，邊緣不整齊，無光澤。革蘭氏染色后呈藍色，及為陽性，有芽孢，呈橢圓或柱狀。

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1蔗糖對納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的蔗糖為保護劑，測定納豆菌活菌的數(shù)量和納豆激酶的酶活力，結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同濃度的蔗糖對納豆菌和納豆激酶的影響Fig.3　Influence of different concentrations of sucrose on Bacillus natto and nattokinase

由圖3數(shù)據(jù)得到，蔗糖對納豆菌和納豆激酶具有一定的保護效果[13]。但是蔗糖不適合糖尿病人，所以不用蔗糖作為納豆的保護劑成分。

2.2.2甘油對納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的甘油為保護劑，測定納豆菌活菌的數(shù)量和納豆激酶的酶活力，結(jié)果如圖4所示。

由圖4數(shù)據(jù)得到，甘油在納豆菌和納豆激酶在凍干過程中起到較好的保護作用[12]。并隨著甘油濃度的增大，納豆激酶酶活力和納豆菌的存活都有提高，但當(dāng)甘油添加量分別達到5%和10%后，對納豆菌的存活和納豆激酶酶活力的影響不再顯著，本研究選擇添加量0%、5%、10%3個水平進行正交試驗。

圖4　不同濃度的甘油對納豆菌和納豆激酶的影響Fig.4　Influence of different concentrations of skim milk powder to Bacillus natto and nattokinase

2.2.3檸檬酸鈉對納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的檸檬酸鈉為保護劑，測定納豆菌的數(shù)量和納豆激酶的酶活，結(jié)果如圖5所示。

圖5　不同濃度的檸檬酸鈉對納豆菌和納豆激酶的影響Fig.5　Influence of different concentrations of xylitol on Bacillus natto and nattokinase

由圖5可以看出，檸檬酸鈉對納豆菌和納豆激酶有一定的保護作用。由于檸檬酸鈉適合糖尿病人食用，因此選用檸檬酸鈉添加量為0%、5%、10%3個水平進行正交試驗。

2.2.4抗壞血酸對納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的抗壞血酸為保護劑，測定納豆菌的數(shù)量和納豆激酶的酶活，結(jié)果如圖6所示。

圖6　不同濃度的抗壞血酸對納豆菌和納豆激酶的影響Fig.6　Inflence of different concentrations of ascorbic acid on Bacillus natto and nattokinase

由圖6看出，抗壞血酸對納豆菌和納豆激酶的保護作用較好[14]?？箟难岬奶砑恿糠謩e達到0%、0.5%、1%時納豆菌的存活和納豆激酶的酶活均顯著增加，抗壞血酸的添加量分別達到1%和1.5%時，納豆菌的存活和納豆激酶的酶活力均未顯著增加，選擇添加量0%、0.5%、1%3個水平做正交試驗。

2.2.5葡聚糖對納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的葡聚糖為保護劑，測定納豆激酶的酶活和納豆菌的數(shù)量，結(jié)果如圖7所示。

圖7　不同濃度的葡聚糖對納豆菌和納豆激酶的影響Fig.7　Influence of different concentrations of lactose to Bacillus natto and nattokinase

由圖7數(shù)據(jù)得到葡聚糖對納豆菌和納豆激酶在有一定的保護作用，但效果并不十分顯著，所以不選擇葡聚糖作為本試驗的凍干保護劑。

2.3正交試驗結(jié)果

選擇甘油的添加量A（%）、抗壞血酸的添加量B （%）和檸檬酸鈉的添加量C（%）為試驗因素設(shè)計L9（34）正交試驗。正交試驗因素水平表見表1所示，正交試驗結(jié)果表見表2所示。

表1　L（934）因素水平表Table 1　Levels and factors of conditions L（934）

表2 正交試驗結(jié)果及分析Table 2 Result and analysis of orthogonal test

續(xù)表2 正交試驗結(jié)果及分析Continue table 2　Result and analysis of orthogonal test

由正交表2可知，對于納豆菌活菌數(shù)來說，9號處理最好，即納豆菌活菌數(shù)最高，其組合為A3B3C2；根據(jù)極差分析和直觀分析圖可知，各因素對納豆菌的影響順序為A（甘油）、B（抗壞血酸）、C（檸檬酸鈉），最佳組合為A3B2C3。

對于納豆激酶酶活來說，5號處理最好，即納豆激酶酶活最高，其組合為A2B2C3；根據(jù)極差大小和直觀分析圖可知，各因素對納豆激酶的影響順序為A（甘油）、C（檸檬酸鈉）、B（抗壞血酸），最佳組合為A2B2C2。

兩個最佳組合有差異，經(jīng)過實際驗證，得出組合A3B2C3，納豆菌數(shù)9.7×108CFU/mL，而納豆激酶酶活力為1 119.865 IU/mL；組合A2B2C2，納豆菌數(shù)為9.5× 108CFU/mL，納豆激酶的酶活力為1 171.569 IU/mL，從實際驗證結(jié)果比較看，雖然A2B2C2的納豆菌有所減少，但是它的納豆激酶酶活力提高了。因此，最終選擇A2B2C2組合作為納豆的凍干保護劑，即甘油5%，抗壞血酸0.5%，檸檬酸鈉5%。

3　結(jié)論

大豆在121℃下蒸煮20 min，按3%的接種量加入納豆菌，發(fā)酵24 h制成納豆。然后從甘油、蔗糖、抗壞血酸、葡聚糖和檸檬酸鈉5種保護劑中，先通過單因素試驗篩選出了抗壞血酸、甘油和檸檬酸鈉3種對納豆激酶和納豆菌具有較好保護效果的保護劑，通過正交試驗得到效果較好的保護劑組合：抗壞血酸0.5%、甘油5%、檸檬酸鈉5%，納豆激酶相對酶活力在此條件下可達1 171.569 IU，納豆菌的存活可達9.5×108cfu/mL，這為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.026

收稿日期：2015-10-15

作者簡介：弓玉紅（1987—），男（漢），助教，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

Study on the Freeze-drying Protective Screening and Optimization and the Preparation of Natto

GONG Yu-hong，TIAN Jing
（Department of Life Science，Lvliang University，Lishi 033000，Shanxi，China）

Abstract：Through single factor，from glycerin，sucrose，ascorbic acid，glucan and sodium citrate selected threematerialswhichhavebetterprotectiveeffectonBacillusnattoandnattokinaseactivity.Thenthoughorthogonal tests selected the best combination of protective agents：5%glycerin，0.5%ascorbic acid，5%sodium citrate. Under these conditions，the nattokinase activity and survival of Bacillus natto reached 1 171.569 IU/mL and 9.5×108CFU/mL.

Key words：natto；cryprotectants；screening；optimize