董　聰，李　芳，王　琳，蘇洪波，孔令明，*（.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊83005；.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊8300）

酶解胡麻籽粕蛋白制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化

董聰1，李芳2，王琳1，蘇洪波1，孔令明1，*
（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830021）

摘要：以胡麻籽粕蛋白粉為原料，分別采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶對(duì)胡麻籽粕蛋白進(jìn)行酶解，以水解度為指標(biāo)對(duì)酶制劑進(jìn)行篩選。通過單因素及正交試驗(yàn)，以抗氧化性為指標(biāo)，獲取最佳酶解工藝。結(jié)果表明，堿性蛋白酶對(duì)胡麻籽粕蛋白的酶解效果較好，胡麻籽粕蛋白的最佳酶解工藝為：底物濃度1.5%，pH 8.5，酶底比3%，超聲波功率300 W，酶解溫度40℃、酶解時(shí)間3 h，在此條件下，胡麻籽粕多肽對(duì)O2-·和OH-·清除能力分別為42%和30%。

關(guān)鍵詞：胡麻籽粕；酶解；多肽；抗氧化活性

胡麻籽為亞麻科植物亞麻L(zhǎng)ium usitatissimum L的干燥成熟種子，是中國(guó)五大油料作物之一，中國(guó)歷年種植面積約為60萬(wàn)hm2，種子產(chǎn)量約為25萬(wàn)t～30萬(wàn)t，主要產(chǎn)區(qū)是山西、甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、河北、新疆等地。種子含脂肪油，油中主要成分為亞麻酸、亞油酸、油酸及少量飽和脂肪酸的甘油酯。此外，尚含黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)等。經(jīng)測(cè)定去油后的胡麻籽粕中含有16.7%的胡麻籽蛋白及8.53%的粗脂肪，而長(zhǎng)期以來胡麻籽粕多被用于肥料和飼料，造成了其中所含的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，將蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解可獲得許多具有多種生物活性的肽，其具有的生物活性包括抗氧化作用、抗病毒、抗高血壓、激素調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等[1]。若使用胡麻籽粕為原料制備胡麻籽蛋白抗氧化活性肽，則極大地增加了產(chǎn)品的附加值，故研究酶解胡麻籽蛋白制備胡麻籽多肽的工藝具有重要意義。

本研究以抗氧化活性為指標(biāo)，對(duì)超聲波輔助胡麻籽粕蛋白的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而提高胡麻籽粕多肽的抗氧化活性。研究成果將為胡麻綜合利用及開發(fā)功能性食品提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑

胡麻籽粕蛋白：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶：均為南寧寵博生物工程有限公司提供；其它試劑均為分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

粉碎機(jī)：上海一恒科技有限公司；XB120A型分析天平：上海天平廠；PHS-3C雷磁：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；全數(shù)字超聲波發(fā)生器：武漢嘉鵬電子有限公司；電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蛋白酶活力測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定采用福林—酚法[2]。

1.2.2粗蛋白含量測(cè)定

粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[3]。

1.2.3氨基氮含量的測(cè)定

氨基氮含量的測(cè)定采用甲醛滴定法[4]。

1.2.4水解度的測(cè)定[5]

水解度（DH）=樣品中的氨基氮含量/樣品中的總氮×100%

1.2.5蛋白質(zhì)酶解工藝流程

胡麻籽粕蛋白→2%懸浮液→熱變性處理→調(diào)pH→酶解→滅酶→離心→取上清液

1.2.6蛋白酶的篩選[6]

選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶在最適酶解條件下對(duì)胡麻籽粕蛋白進(jìn)行酶解，以水解度為指標(biāo)，篩選出的最適的酶制劑。

1.2.7抗氧化能力的測(cè)定

OH-·清除能力的測(cè)定—采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[7]；O2-·清除能力的測(cè)定—采用鄰苯三酚方法[8]。

1.2.8單因素試驗(yàn)

選定最佳蛋白酶后，以抗氧化性為指標(biāo)，比較在酶解過程中pH、溫度、酶解時(shí)間、底物濃度、超聲波功率、酶底比對(duì)胡麻籽粕多肽抗氧化能力的影響。

1.2.9酶解工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以抗氧化性為指標(biāo)，選擇A（底物濃度）、B（pH）、C（酶底比）、D（超聲波功率）進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1　試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1　Factor level of experimental design

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白酶活力

經(jīng)測(cè)定，木瓜蛋白酶活力為10.1萬(wàn)U/g，堿性蛋白酶活力為13.6萬(wàn)U/g，中性蛋白酶36.6萬(wàn)U/g。

2.2粗蛋白含量

根據(jù)凱氏定氮法測(cè)得胡麻籽粕蛋白質(zhì)中粗蛋白含量為74.5%。

2.3酶的篩選

經(jīng)測(cè)定，木瓜蛋白酶水解度為15.65%，堿性蛋白酶水解度為17.28%，中性蛋白酶水解度為16.44%。

由測(cè)定結(jié)果可知，3種蛋白酶在其最適宜條件下對(duì)胡麻籽粕蛋白進(jìn)行酶解，以堿性蛋白酶酶解效果較好，故選用堿性蛋白酶作為酶解胡麻籽粕蛋白的最適酶制劑。

2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1pH對(duì)抗氧化能力的影響

在溫度50℃、酶解時(shí)間2 h、底物濃度2%、超聲波功率為400 W、酶底比為5%、pH分別為8、9、10、11的酶解條件下，測(cè)定抗氧化能力如圖1所示。

圖1　pH對(duì)胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.1　Effect of pH on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖1可知，當(dāng)pH為9時(shí)，抗氧化能力達(dá)到最高值，pH繼續(xù)增大，多肽對(duì)OH-·清除能力有所下降，對(duì)O2-·清除能力趨于平緩，即確定酶解反應(yīng)的最適pH 為9。

2.4.2酶解溫度對(duì)抗氧化能力的影響

在pH9、酶解時(shí)間2 h、底物濃度2%、超聲波功率為400 W、酶底比為5%、溫度分別為30、40、50、60℃的酶解條件下，測(cè)定抗氧化能力如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，抗氧化能力達(dá)到最高值，溫度繼續(xù)增大，多肽對(duì)OH-·清除能力有所下降，對(duì)O2-·清除能力趨于平緩，即確定酶解反應(yīng)的最適溫度為40℃。

2.4.3酶解時(shí)間對(duì)抗氧化能力的影響

在pH9、溫度50℃、底物濃度2%、超聲波功率為400 W、酶底比為5%、酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h的酶解條件下，測(cè)定抗氧化能力如圖3所示。

圖2　溫度對(duì)胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.2　Effect of temperature on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

圖3　時(shí)間對(duì)胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.3　Effect of time on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖3可知，當(dāng)時(shí)間為3 h時(shí)，抗氧化能力達(dá)到最高值，時(shí)間繼續(xù)增長(zhǎng)，多肽對(duì)OH-·清除能力有所下降，對(duì)O2-·清除能力趨于平緩但不再增加，即確定酶解反應(yīng)的最適時(shí)間為3 h。

2.4.4底物濃度對(duì)抗氧化能力的影響

在pH9、溫度50℃、酶解時(shí)間2 h、超聲波功率為400 W、酶底比為5%、底物濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的酶解條件，測(cè)定抗氧化能力如圖4所示。

圖4　底物濃度對(duì)胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖4可知，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，抗氧化值達(dá)到最高，底物濃度繼續(xù)增大，多肽對(duì)OH-·清除能力有所下降，對(duì)O2-·清除能力趨于平緩但呈下降趨勢(shì)，即確定酶解反應(yīng)的最適底物濃度為2%。

2.4.5超聲波功率對(duì)抗氧化能力的影響

在pH9、溫度50℃、酶解時(shí)間2 h、底物濃度2%、酶底比為5%、超聲波功率分別為200、300、400、500、600 W的酶解條件，測(cè)定抗氧化能力如圖5所示。

圖5　超聲波功率對(duì)胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.5　Effect of ultrasonic power on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖5可知，當(dāng)超聲波為300 W時(shí)，抗氧化值達(dá)到最高，超聲波繼續(xù)增大，多肽對(duì)OH-·清除能力有所下降，對(duì)O2-·清除能力隨之減弱，即確定酶解反應(yīng)的最適超聲波功率為300 W。

2.4.6酶底比對(duì)抗氧化能力的影響

在pH9、溫度50℃、酶解時(shí)間2 h、超聲波功率為400W、底物濃度2%、酶底比分別為1%、3%、5%、7%、9%的酶解條件，測(cè)定抗氧化能力如圖6所示。

圖6　酶底比對(duì)胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.6　Effect of enzyme substrate ratio on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖6可知，當(dāng)酶底比為3%時(shí)，抗氧化值達(dá)到最高，酶底比繼續(xù)增大，多肽對(duì)OH-·清除能力有所下降，對(duì)O2-·清除能力隨之減弱，即確定酶解反應(yīng)的最適酶底比為3%。

2.5正交試驗(yàn)結(jié)果分析

通過以上單因素試驗(yàn)可知，pH、溫度、時(shí)間、底物濃度、超聲波功率、酶底比對(duì)胡麻籽粕蛋白酶解物的抗氧化性都有一定的影響，現(xiàn)以A（底物濃度）、B （pH）、C（酶底比）、D（超聲波功率）進(jìn)行正交試驗(yàn)。由正交試驗(yàn)得胡麻籽粕多肽酶解液的抗氧化性能結(jié)果如表2所示。

根據(jù)極差R大小，得出各因素影響OH-·清除能力的次序?yàn)椋篋（超聲波功率）＞B（pH）＞C（酶底比）＞A（底物濃度），影響O2-·清除能力的次序?yàn)椋篊（酶底比）＞B（pH）＞D（超聲波功率）＞A（底物濃度）。結(jié)果表明：胡麻籽蛋白抗氧化能力的最佳工藝參數(shù)為：A1B1C2D2，即底物濃度為1.5%，pH為8.5，酶底比為3%，超聲波功率為300 W，此條件下多肽抗氧化能力最強(qiáng)。

對(duì)得出工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果得出胡麻籽粕多肽對(duì)OH-·和O2-·的清除能力分別為42%和30%。與正交試驗(yàn)2號(hào)相比較有較大提高，說明正交試驗(yàn)得出的工藝參數(shù)可靠。

表2　胡麻籽粕多肽酶解液的抗氧化性能Table 2　Antioxidant properties of linseed meal peptide

3　結(jié)論

1）各因素影響OH-·清除能力的次序?yàn)椋撼暡üβ剩緋H＞酶底比＞底物濃度，影響O2-·清除能力的次序?yàn)椋好傅妆龋緋H＞超聲波功率＞底物濃度。

2）在堿性蛋白酶的作用下，胡麻籽粕蛋白的最佳酶解工藝為：底物濃度2%、pH 9.5、酶底比3%、超聲波功率300 W、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間3 h。在此條件下，胡麻籽粕多肽對(duì)OH-·和O2-·的清除能力分別為42%和30%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.028

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)優(yōu)秀青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目“超聲聯(lián)合超微粉碎生產(chǎn)胡麻籽蛋白粉的技術(shù)研究及產(chǎn)品開發(fā)”（2013721024）

收稿日期：2014-05-17

作者簡(jiǎn)介：董聰（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及綜合利用。

*通信作者

Optimization the Process of Enzymatic Linseed Meal Protein Preparation Anti-oxidation Peptide

DONG Cong1，LI Fang2，WANG Lin1，SU Hong-bo1，KONG Ling-ming1，*
（1.College of Food and pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China）

Abstract：Linseed meal protein powder was used as raw material.Papain，alcalase，neutral protease were used respectively to linseed meal protein on enzyme.Degree of hydrolysis as an indicator for screened the enzymes. Regard antioxidant activity as an indicator for optimal enzymatic processes by orthogonal.The results showed thatalcalase was optimal protease.The optimal enzymatic process of linseed meal protein：substrate concentration 2%，pH 9.5，enzyme-substrate ratio 3%，ultrasonic power 300 W，hydrolysis temperature 40℃，hydrolysis time 3 h，under this conditions，the effects of scavenging on O2-·and OH-·were 42%and 30%.

Key words：linseed meal；enzymatic；peptides；antioxidant activity