相啟森，李世果，馬云芳，董吉林，申瑞玲（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002）

丙烯酰胺誘導(dǎo)BRL-3A鼠肝細胞中環(huán)氧合酶-2表達

相啟森1，2，李世果1，2，馬云芳1，2，董吉林1，2，申瑞玲1，2
（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002）

摘要：環(huán)氧合酶-2（COX-2）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲過程中發(fā)揮了重要的作用。丙烯酰胺是存在于環(huán)境和食品中的一種潛在致癌物質(zhì)，但目前鮮見丙烯酰胺能否誘導(dǎo)正常肝細胞中COX-2表達的研究報道。本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測丙烯酰胺對BRL-3A鼠正常肝細胞中COX-2表達的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺能夠以濃度依賴和時間依賴的方式誘導(dǎo)BRL-3A大鼠正常肝細胞中COX-2表達，表明丙烯酰胺有可能通過誘導(dǎo)正常肝細胞中COX-2表達而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

關(guān)鍵詞：丙烯酰胺；BRL-3A鼠肝細胞；環(huán)氧合酶-2

丙烯酰胺（Acrylamide，ACR）是一種重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于污水處理、造紙、石油開采、紡織、選礦、涂料等行業(yè)[1-2]。環(huán)境中的丙烯酰胺可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑進入人體并產(chǎn)生毒性作用[3]。2002年4月，瑞典國家食品管理局（National Food Administration，NFA）發(fā)現(xiàn)富含淀粉的食物在高溫加熱過程中能夠產(chǎn)生丙烯酰胺，食品中丙烯酰胺污染成為國內(nèi)外研究熱點[4]。大量研究證實丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性和生殖毒性等多重毒性，其潛在致癌性被廣泛關(guān)注[5-8]。1994年，國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將丙烯酰胺列為人類可能致癌物（2A組）[7]。環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸合成前列腺素過程中的重要限速酶，包括組成型COX-1和誘導(dǎo)型COX-2[9]。大量研究表明，COX-2在結(jié)腸癌、乳腺癌、口腔癌等腫瘤組織中高表達并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了重要的生理功能[9-11]。哺乳動物的肝臟是丙烯酰胺等外源化學(xué)毒物作用的主要靶器官。丙烯酰胺能夠通過多種機制對肝組織和肝細胞造成損傷[12-13]，并可能引發(fā)肝組織的癌變[14]。但目前鮮見丙烯酰胺能否誘導(dǎo)肝細胞中COX-2表達的研究報道。本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測丙烯酰胺對BRL-3A鼠正常肝細胞中COX-2表達的影響，以期為揭示丙烯酰胺對肝臟的致腫瘤作用提供思路。

1　材料與方法

1.1材料

BRL-3A鼠正常肝細胞株：中國科學(xué)院上海典型培養(yǎng)物保藏細胞庫；小牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基：美國Hyclone公司；羊抗COX-2（sc-1745）、羊抗βactin（sc-1616）抗體和驢抗羊IgG抗體（sc-1747）：美國Santa Cruz公司；丙烯酰胺（ACR）、甘氨酸、N，N'-亞甲雙丙烯酰胺、N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED）、Tris堿、溴酚藍和過硫酸銨：美國Amresco公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）印跡膜：美國Millipore公司；總蛋白提取試劑RIPA裂解液和青霉素/鏈霉素溶液：碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2主要儀器

Mini-Protean Tetra小型垂直電泳槽、PowerPacTM通用電泳儀電源、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽和ChemiDocTMXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Thermo 3110型CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo Scientific公司；5427R型臺式高速冷凍離心機：德國Eppendof公司。

1.3細胞培養(yǎng)及處理

BRL-3A細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[15]。待細胞生長至90%融合時，用含不同濃度ACR的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h或2.5 mmol/L ACR處理不同時間。

1.4蛋白樣品制備

BRL-3A細胞經(jīng)ACR處理結(jié)束后，棄上清液，用冷PBS洗滌2次，加入預(yù)冷RIPA細胞裂解液，置于冰上10 min使細胞充分裂解，將細胞輕輕刮下并轉(zhuǎn)移到微量離心管中，離心10 min（15 000 r/min，4℃），離心后所得上清液為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量分析試劑盒測定其蛋白濃度并將各樣品蛋白濃度調(diào)整至相等；在各組樣品中加入5×上樣緩沖液，混合均勻，于100℃加熱煮沸5 min使蛋白變性，混勻后進行SDSPAGE電泳[16]。

1.5COX-2表達水平檢測

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜，將膜放入含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液，于水平搖床室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后，用TBST將PVDF膜洗滌3次，每次10 min；然后將膜放入一抗孵育溶液中，4℃孵育過夜；一抗孵育結(jié)束后，將PVDF膜用TBST振搖洗滌3次，每次10 min；然后將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液中，室溫緩慢搖動孵育2 h。二抗孵育結(jié)束后，將膜用TBST振搖洗滌3次，每次10 min；加ECL顯色液，采用Chemi-DocTMXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行成像，Quantity One 4.6.2軟件分析各蛋白條帶的光密度值[16]。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，各組間的差異比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度丙烯酰胺對BRL-3A細胞中COX-2表達的影響

分別用終濃度為1.0、2.5、5.0 mmol/L的丙烯酰胺處理BRL-3A細胞24 h，丙烯酰胺濃度對誘導(dǎo)COX-2表達的影響見圖1。

圖1　丙烯酰胺濃度對BRL-3A細胞中COX-2表達的影響Fig.1　Effects of acrylamide concentration on COX-2 expression in BRL-3A cells

如圖1可知，BRL-3A細胞在正常條件下COX-2蛋白低表達。經(jīng)不同濃度丙烯酰胺（1.0、2.5、5.0 mmol/L）處理24 h后，BRL-3A細胞中COX-2蛋白表達水平明顯升高，并且丙烯酰胺對COX-2表達的誘導(dǎo)作用隨其添加濃度的升高而增強。

蛋白條帶的光密度定量分析結(jié)果見圖2。

圖2　定量分析蛋白免疫印跡條帶的光密度Fig.2　Densitometric quantification of Western blot protein bands

由圖2可知，2.5 mmol/L和5.0 mmol/L丙烯酰胺處理組細胞中COX-2蛋白表達水平分別與空白組存在極顯著差異（P<0.01）。以上結(jié)果表明丙烯酰胺能以濃度依賴的方式誘導(dǎo)BRL-3A細胞中COX-2蛋白表達。

2.2丙烯酰胺處理時間對BRL-3A細胞中COX-2表達的影響

分別用丙烯酰胺（終濃度為2.5 mmol/L）處理BRL-3A細胞0、3、6、12、24 h，丙烯酰胺處理濃度對其誘導(dǎo)COX-2表達的影響見圖3。

圖3　處理時間對丙烯酰胺誘導(dǎo)BRL-3A細胞中COX-2表達的影響Fig.3　Effects of exposure time on acrylamide-induced COX-2 expression in BRL-3A cells

如圖3所示，經(jīng)丙烯酰胺（2.5 mmol/L）處理0～3 h，BRL-3A細胞中COX-2蛋白表達水平未明顯升高；從6 h開始到24 h，COX-2表達水平逐步升高。

蛋白條帶的光密度定量分析結(jié)果見圖4。

圖4　定量分析蛋白免疫印跡條帶的光密度Fig.4　Densitometric quantification of Western blot protein bands

由圖4可知，2.5 mmol/L丙烯酰胺處理3 h后，BRL-3A細胞中COX-2蛋白表達水平與空白組存在顯著差異（P<0.05），6、12、24 h處理組COX-2蛋白表達水平與空白組存在極顯著差異（P<0.01）。以上結(jié)果表明丙烯酰胺能以時間依賴的方式誘導(dǎo)BRL-3A細胞中COX-2蛋白的表達。

3　結(jié)論與討論

作為花生四烯酸合成前列腺素過程中的一個重要的限速酶，COX-2在正常組織中不表達或微弱表達，但其在結(jié)腸癌、乳腺癌、口腔癌、前列腺癌等腫瘤中普遍存在過度表達的現(xiàn)象[9-11，17]。研究表明，COX-2可能通過促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡、誘導(dǎo)腫瘤血管生成、活化前致癌物等多種分子機制參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[9，18]。作為人類可能的致癌物質(zhì)，丙烯酰胺廣泛存在于各種化學(xué)制品和高溫加熱的食品中。雖然沒有確切研究表明丙烯酰胺與人類癌癥發(fā)生相關(guān)，本研究證實丙烯酰胺能夠以濃度依賴和時間依賴的方式誘導(dǎo)BRL-3A大鼠正常肝細胞中COX-2表達，表明丙烯酰胺有可能通過誘導(dǎo)正常細胞中COX-2表達而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。在今后的研究中，應(yīng)采用動物試驗并結(jié)合特異性COX-2抑制劑進一步明確丙烯酰胺誘導(dǎo)正常細胞中COX-2表達與其致腫瘤作用之間的關(guān)系，并采用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法揭示丙烯酰胺誘導(dǎo)COX-2表達的分子機制。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.006

收稿日期：2014-05-20

基金項目：鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金（NO.2013BSJJ079）

作者簡介：相啟森（1984—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)。

Acrylamide Induces Cyclooxygenase-2 Expression in BRL-3A Rat Liver Cells

XIANG Qi-sen1，2，LI Shi-guo1，2，MA Yun-fang1，2，DONG Ji-lin1，2，SHEN Rui-ling1，2
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，Henan，China；2.Henan Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety，Zhengzhou 450002，Henan，China）

Abstract：Cyclooxygenase-2（COX-2）plays a key role in the development，progression，and invasion ofhuman cancer.Acrylamide is a kind of potential carcinogen，which exists widely in the environment and foods. Whether acrylamide can induce the expression of COX-2 in normal hepatocytes is not fully understood.In the present study，the effects of acrylamide on COX-2 expression in Buffalo rat liver 3A（BRL-3A）cells were investigated with western blotting analysis.The results indicated that acrylamide could induce the expression of COX-2 in a dose-and time-dependent manner，suggesting that acrylamide may participate in the development and progression of cancer through inducing COX-2 expression in normal liver cells.

Key words：acrylamide；BRL-3A rat liver cells；cyclooxygenase-2