王佳麗，夏　泉，2，陳飛虎，喬文豪，張冬玲

◇藥學研究◇

4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人胃癌SGC-7901細胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學研究

王佳麗1，夏泉1，2，陳飛虎1，喬文豪1，張冬玲1

摘要目的研究觀察新型維甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（ATPR）作用于胃癌SGC-7901細胞后蛋白質(zhì)的磷酸化情況來了解ATPR誘導分化作用的可能機制和作用靶點。方法ATPR作用于胃癌SGC7901細胞48 h后，收集并提取總蛋白，通過胰蛋白酶酶解，TiO2磁珠法富集磷酸肽，高分辨率液質(zhì)聯(lián)用儀器檢測磷酸肽，使用Proteome Discoverer1．2軟件尋找差異的蛋白質(zhì)和磷酸化位點，利用生物信息學網(wǎng)站和DAVID、KEGG、IPA軟件，分析這些磷酸化蛋白質(zhì)的功能及亞細胞定位等信息。結(jié)果最終鑒定出109個蛋白質(zhì)，其中45個磷酸化蛋白質(zhì)，共有121個磷酸化位點，差異蛋白中有15個僅出現(xiàn)在ATPR組，20個僅出現(xiàn)在正常組。DAVID分析結(jié)果顯示差異磷酸化的蛋白質(zhì)參與調(diào)控細胞進程、生物進程、基因表達、細胞的代謝過程等；KEGG分析結(jié)果顯示差異磷酸化蛋白質(zhì)主要有參與ERBB信號通路、RNA的轉(zhuǎn)運、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程、p53信號通路等。IPA軟件分析一些差異蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)蛋白是泛素連接酶（UBC）。結(jié)論ATPR對胃癌細胞SGC-7901細胞誘導分化的機制可能是通過作用于多種蛋白質(zhì)或基因，如肝癌衍生生長因子（HDGF）、鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）、ATP結(jié)合盒G亞族蛋白4（ABCG4）和腺苷酸環(huán)化酶關(guān)聯(lián)蛋白1（CAP1）而發(fā)揮作用，并通過影響這些蛋白質(zhì)的磷酸化從而實現(xiàn)ATPR對胃癌細胞的誘導分化作用。

關(guān)鍵詞ATPR；人胃癌SGC-7901細胞；誘導分化；磷酸化蛋白質(zhì)組學

2015-06-29接收

2安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥230022

夏泉，男，碩士生導師，責任作者，E-mail：xiaquan2010＠163．com

全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）作為常用誘導分化劑已廣泛應(yīng)用，在臨床上主要用于急性早幼粒細胞白血病的治療，其機制是能誘導腫瘤細胞分化成正常細胞或誘導腫瘤細胞凋亡，從而達到治愈目的。臨床發(fā)現(xiàn)維甲酸類藥物有嚴重的綜合征、耐藥以及復發(fā)率高等缺陷，使得其應(yīng)用受限。實驗室以ATRA為先導化合物，對其進行結(jié)構(gòu)修飾，再經(jīng)過體外藥效學篩選，發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR）具有較強的抗腫瘤增殖和誘導分化活性，期望開發(fā)成為一種新型抗腫瘤藥。該研究以人胃癌細胞株SGC-7901為研究對象，通過磷酸化蛋白質(zhì)組學的方法，研究ATPR作用于胃癌細胞后蛋白質(zhì)的表達變化，并找到作用靶點來解釋其可能誘導分化作用機制。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞株與藥物SGC-7901細胞株購自中科院上海細胞庫。ATPR由安徽醫(yī)科大學藥學院合成，純度為99．66%，以無水乙醇溶解配制成濃度為2×10-2mol／L的貯存液，-20℃避光保存，見圖1。

1．1．2主要試劑與儀器磷酸酶抑制劑（貨號88667）和去污劑去除樹脂（貨號87778）購自美國Pierce公司；Trypsin（貨號V5280）購自美國Promega公司；二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM）購自美國Sigma公司；羥基乙酸和25%氨水溶液購自美國Aladdin公司；Strata-X固相小柱（60 mg／3 ml）購自美國Phenomenex公司；TiO2Mag sepharose（貨號28-9440-10）購自英國GE healthcare；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；丙酮、乙腈、醋酸、甲酸、三氟乙酸為色譜級。酶標儀、ACCELA 600 Pump液相色譜、傅立葉變換靜電場軌道肼質(zhì)譜（LTQ Orbitrap XL）、Xcalibur2．1工作站和 Proteome Discoverer軟件購自美國Thermo公司；高速冷凍離心機購自美國Beckman公司。

1．2方法

1．2．1細胞培養(yǎng)和加藥收集處理胃癌SGC-7901細胞株為貼壁生長細胞株，采用含10%小牛血清（FCS）的高糖DMEM（青霉素100 IU／ml和鏈霉素100μg／ml）培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2 d更換培養(yǎng)液1次，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。將其分為兩組，ATPR組：ATPR藥物終濃度為1×10-6mol／L；正常組：0．05%無水乙醇的培養(yǎng)基，孵育48 h后收集細胞。

1．2．2磷酸化蛋白質(zhì)組學樣品制備收集細胞，加入500μl裂解液（臨用前加入2μl蛋白酶抑制劑與5μl磷酸酶抑制劑），搖床震蕩裂解約15 min后，14 000 r／min 4℃離心15 min，吸出上清液，總蛋白定量后取1 mg細胞總蛋白，加入丙酮過夜沉淀。離心收集沉淀后加入125μl復溶液（尿素7 mol／L、硫脲2 mol／L、CHAPS 65 mmol／L），完全溶解后加入875 μl 50 mmol／L NH4HCO3混勻。蛋白溶解液加入10 μl 100 mmol／L的DTT，50℃15 min；加入10μl300 mmol／L的IAM，避光放置15 min，加入20μg胰酶（酶∶蛋白＝1∶50）于37℃恒溫水浴鍋過夜孵育17 h。使用去污劑去除樹脂處理酶解液，室溫孵育2 min后，1 000 r／min離心2 min，收集液體脫鹽處理。

1．2．3脫鹽Strata-X柱活化柱子和平衡后加載酶解液樣品，Milli-Q水洗柱子，1 000 r／min離心2 min去除殘留水液。加入2%甲酸／98%甲醇收集洗脫液，真空濃縮儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。

1．2．4磷酸肽的富集（TiO2磁珠法）吸出50μl重懸的磁珠膠漿加入500μl結(jié)合緩沖液（1 mol／L羥基乙酸、80%乙腈、5%TFA），置于磁場中吸去液體；脫鹽后的樣品加入250μl溶液，加入磁珠內(nèi)室溫孵育30 min后，吸去液體；加入500μl結(jié)合緩沖液洗滌后吸去液體，再加入500μl洗滌緩沖液并吸去液體；加入50μl 5%氨水洗滌磁珠，收集液體于真空濃縮儀干燥。

1．2．5高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）分析富集的磷酸化樣品用LC-MS／MS檢測。干燥樣品溶解于30μl0．1%甲酸，流動相A為0．1%甲酸水溶液，流動相B為100% 乙腈溶液，使用180 min梯度洗脫樣品：0～10 min，B相為10%；10～110 min，B相從10%上升至40%；110～140 min，B相從40%上升至95%；140～165min，B相維持95%；165 ～170 min，A相從5%上升至90%；170～180 min，A相維持90%。洗脫肽段經(jīng)由納升級電噴霧離子源接口噴出，進入LTQ Orbitrap XL高分辨率質(zhì)譜儀進行進行質(zhì)譜分析。具體質(zhì)譜條件如下：采用數(shù)據(jù)依賴模式，在正離子模式下進行掃描，電噴霧電壓：3．8 kV；離子傳輸毛細管溫度為200℃；質(zhì)量掃描范圍：300～2 000；一級質(zhì)譜Orbitrap分辨率：60 000；10個LTQ串級質(zhì)譜掃描；母離子窗口：2 Da；串級質(zhì)譜碰撞歸一化能量：35；中性離子丟失：97．98、65．32、45．99、32．66。

1．2．6磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定和生物信息學分析通過Proteome Discovery 1．2軟件對質(zhì)譜產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件進行Sequest搜索，數(shù)據(jù)庫為人源的蛋白序列數(shù)據(jù)庫，來源于ftp：／／ftp．uniprot．org／pub／databases／uniprot／current＿release／knowledgebase／proteomes／。檢索參數(shù)如下：M／Z為350～5 000 Da，母離子容忍度為10 ppm，碎片離子容忍度為0．8 Da，半胱氨酸的烷基化修飾Carbamidomethyl／＋57．021 Da（C）為固定修飾，甲硫氨酸的氧化Oxidation／＋15．995 Da （M）為可變修飾，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸上的磷酸化修飾（Phospho／＋79．966 Da，S、T、Y），肽段和蛋白質(zhì)鑒定FDR均小于1%，磷酸化肽段的過濾時選擇肽段可信度為高。差異磷酸化蛋白質(zhì)用DAVID、KEGG和IPA進行生物信息學分析。

1．3統(tǒng)計學處理采用SPSS 13．0軟件進行分析，實驗結(jié)果以±s表示。

2　結(jié)果

2．1質(zhì)譜分離和鑒定效果的驗證結(jié)果在對總蛋白量為1 mg樣品進行磷酸化蛋白質(zhì)組學研究的同時，使用標準牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）驗證酶解效果并事先飽和毛細管柱。BSA經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，肽段覆蓋率達51．56%，得分值為316，說明分離效果較好，可以用于后續(xù)的正式實驗。

2．2磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果通過TiO2磁珠富集磷酸肽和質(zhì)譜儀器進行鑒定，鑒定出45個差異磷酸化蛋白質(zhì)，121個磷酸化位點，其中絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸位點分別為81、34、6個；這些差異磷酸化蛋白質(zhì)中有15個僅出現(xiàn)在ATPR組，20個蛋白質(zhì)僅出現(xiàn)在正常組。肝癌衍生生長因子（hepatoma-derived growth factor，HDGF）、鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin，CAST）、ATP結(jié)合盒G亞族蛋白4（ATP-binding cassette sub-family Gmember4，ABCG4）和腺苷酸環(huán)化酶關(guān)聯(lián)蛋白1（adenylyl cyclase-associated protein 1，CAP1）的磷酸化發(fā)生變化，可能是ATPR作用后的結(jié)果，見圖2。

2．3磷酸化蛋白質(zhì)的功能分析通過DAVID分析已鑒定的差異磷酸化蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組成及分子功能，這些蛋白質(zhì)主要參與蛋白質(zhì)和大分子的代謝過程、蛋白質(zhì)的生物合成過程、基因表達等，并主要參與構(gòu)成細胞核（22．2%）、細胞質(zhì)（22．2%）；經(jīng)過分子功能分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質(zhì)主要參與蛋白質(zhì)與核酸的連接。KEGG pathway分析差異磷酸化蛋白質(zhì)可能參與的信號通路，主要有ERBB信號通路、RNA的降解、RNA的轉(zhuǎn)運、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程、剪接體形成、p53信號通路等，見圖3。

2．4磷酸化蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析IPA軟件分析差異蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)泛素連接酶（ubiquitin ligase，UBC）成為了CAST與CAP1、DNA同源家族C蛋白5（dnaJ homolog subfamily Cmember 5，DNAJC5）與核帽連接蛋白1（nuclear cap-binding protein subunit 1，NCBP1）、結(jié)節(jié)蛋白（tuberin，TSC2）與 mRNA脫帽增強蛋白4（enhancer of mRNA-decapping protein 4，EDC4）之間的關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)，提示泛素連接酶參與了調(diào)節(jié)RNA和凋亡的各個過程，見圖4。

3　討論

課題組前期以ATRA為先導化合物設(shè)計合成了維甲酸衍生物ATPR，并證實其對白血?。?］、卵巢癌［2］、乳腺癌［3］等多種腫瘤細胞株具有良好的抑制增殖和誘導分化作用。磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及抗腫瘤作用機制研究中已廣泛應(yīng)用，蛋白質(zhì)的磷酸化水平的變化更能反映蛋白質(zhì)的表達變化。該研究是對ATPR作用于胃癌SGC-7901細胞后細胞內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)組學的研究，結(jié)果表明HDGF、CAST、ABCG4和CAP1發(fā)揮重要作用，并通過影響這些蛋白質(zhì)的磷酸化從而實現(xiàn)ATPR對胃癌細胞的誘導分化作用。

HDGF是Nalamura et al［4］在人肝癌細胞系（HuH-7）無血清培養(yǎng)的上清液中分離得到的一種生長因子，具有一系列生物功能，在促進癌細胞增殖、侵襲、遷移等過程發(fā)揮重要作用，包括食管癌［5］、肺癌［6］、黑色素瘤［7］等。臨床病理學分析［8］表明HDGF的高表達與乳腺癌、胰腺癌的預后差有聯(lián)系。ABCG4是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族成員，張志培等［9］發(fā)現(xiàn)ABCG4在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中表達升高，并發(fā)現(xiàn)ABCG4有外排藥物引起腫瘤耐藥的可能性，可成為耐藥的潛在靶點。本研究中HDGF和 ABCG4僅在正常組出現(xiàn)磷酸化，可能是ATPR作用后抑制了它們的表達，從而可能減少耐藥性的發(fā)生。CAP1是細胞骨架蛋白，參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架。Hua et al［10］發(fā)現(xiàn)，CAP1在上皮卵巢癌細胞EOC細胞中高表達，敲除CAP1基因結(jié)果提示下調(diào)CAP1在腫瘤中的表達是治療EOC的新的靶點。S307／309位點發(fā)生磷酸化對CAP1的活性具有調(diào)節(jié)作用。而本研究中CAP1磷酸化位點S307和S309僅在正常組中出現(xiàn)，驗證了CAP1在腫瘤細胞骨架中的調(diào)節(jié)作用。

參考文獻

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The phosphoproteom ics of the differentiation of 4-am ino-2-trifluorom ethyl-phenyl retinate on
human gastric cancer SGC-7901 cells

Wang Jiali1，Xia Quan1，2，Chen Feihu1，et al
（1College of Pharmacy，AnhuiMedical University，Hefei230032；2Dept of Pharmacy，
The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate levels of phosphorylation of protein when the new retinoid derivatives 4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate（ATPR）on gastric cancer SGC-7901 cells，which could help to understand the possible mechanism of differentiation，and found the targets by phosphoproteomics．MethodsGastric cancer SGC-7901 cellswere incubated for48 hourswith ATPR，collected and extracted of total cell protein，digested by trypsin，phosphopeptideswere enriched by TiO2beads and analyzed by LC-MS／MS．Used Proteome Discoverer1．2 to find different proteins and phosphosites．Bioinformatic was applied to analyze the function and subcellular localization of phosphorylated proteins to explain these different proteins by DAVID，KEGG，IPA software．Resu ltsWe identified 109 proteins，including 45 phosphoproteins and 121 phosphosites by analysis of MS．15 proteins appeared on the ATPR group and 20 proteins in the control group．DAVID analysis results displayed that different phosphorproteins were involved in regulating cellular process，biological process，gene expression，metabolic process and so on；the molecular functions of different phosphoproteinsmay include protein binding and nucleic acid binding．ERBB signaling pathway，RNA transport，Protein processing in endoplasmic reticulum，p53 signaling pathway were involved by KEGG analysis．IPA software results displayed that the ubiquitin ligase（UBC）became associated protein of several proteins．ConclusionATPR can induce differentiation of gastric cancer cell SGC-7901，themechanism may be the results of interaction of proteins or genes，such as HDGF，CAST，ABCG4 and CAP1，and regulate the phosphorylation of these proteins．

Key wordsATPR；gastric cancer SGC-7901 cells；induced differentiation；phosphoproteomic

中圖分類號R 341

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1625-04

基金項目：國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（編號：2011ZX09401-021）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學藥學院，合肥230032

作者簡介：王佳麗，女，碩士研究生；