趙　明，范楚玲，郭　強(qiáng)，汪思應(yīng)，李菲菲

RunX2的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

趙明，范楚玲，郭強(qiáng)，汪思應(yīng)，李菲菲

摘要目的構(gòu)建人RunX2真核表達(dá)載體，觀察RunX2對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR （RT-PCR）擴(kuò)增、酶切、連接等基因重組技術(shù)將人RunX2基因插入pcDNA3．1真核表達(dá)載體中；并經(jīng)酶切、PCR、測(cè)序鑒定；將構(gòu)建的RunX2真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，利用Western blot法檢測(cè)RunX2蛋白表達(dá)，用MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)影響。結(jié)果構(gòu)建的RunX2真核表達(dá)載體在MCF-7細(xì)胞中高表達(dá)RunX2蛋白；發(fā)現(xiàn)高表達(dá)RunX2的MCF-7細(xì)胞活力增加，移動(dòng)能力增強(qiáng)。結(jié)論構(gòu)建的RunX2真核表達(dá)載體能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

關(guān)鍵詞RunX2；乳腺癌

2015-07-31接收

汪思應(yīng)，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：sywang ＠ahmu．edu．cn；

李菲菲，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：349711832＠qq．com

RunX2是一種參與成骨分化和骨發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子［1］。在乳腺組織中，RunX2也參與某些基因的表達(dá)調(diào)控，在乳腺上皮細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，并與乳腺腫瘤細(xì)胞株的侵襲性密切相關(guān)［2］。本課題組研究顯示RunX2通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)促發(fā)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移（待發(fā)表）。這一結(jié)果提示RunX2可能成為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的一個(gè)標(biāo)志物。為進(jìn)一步探討RunX2與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，該研究利用亞克隆技術(shù)構(gòu)建人RunX2真核表達(dá)載體，并通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，以探討RunX2對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，初步了解其在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的機(jī)制。

1　材料與方法

1．1細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MB-231細(xì)胞由本室長(zhǎng)期保存。培養(yǎng)條件：配制含有DMEM、10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1．2主要試劑和儀器根據(jù)NCBI Reference Sequence軟件分析設(shè)計(jì)RunX2引物，引物由Invitrogen公司合成，PCR反應(yīng)試劑、DNA限制性內(nèi)切酶及DNA Marker購(gòu)于TaKaRa公司，DMEM、胰酶、FBS均購(gòu)于Gibco公司，Western blot相關(guān)試劑購(gòu)于上海生物工程公司，RunX2抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，PVDF膜購(gòu)于Millipore公司。PCR儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品。?

1.3PCR擴(kuò)增提取人乳腺癌細(xì)胞MB-231的總RNA，以此為模板行RT-PCR擴(kuò)增RunX2片段。引物：上游3′-CCG CTCGAG ATG GCA TCA AAC AGC CTC-5′；下游3′-TCC CCG CGG ATA TGG TCG CCA AAC AGA-5′（下劃線部分為酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)體系：25μl，變性溫度98℃10 s，退火溫度55℃5 s，延伸溫度72℃10 s，反應(yīng)35個(gè)循壞。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)一條1 kb左右的片段?；厥彰盖泻蠼?jīng)測(cè)序鑒定。

1.4人RunX2真核表達(dá)載體的構(gòu)建將上述1 kb左右的片段回收酶切后用T4 DNA連接酶鏈接于pcDNA3．1真核表達(dá)載體，鏈接產(chǎn)物做小規(guī)模細(xì)菌轉(zhuǎn)化，PCR及雙酶切后經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)。

1.5pcDNA3.1-RunX2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 MCF-7細(xì)胞1 ×106個(gè)細(xì)胞接種于90 mm平皿，待貼壁后長(zhǎng)至70%密度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染pcDNA 3．1-RunX2質(zhì)粒10 μg、脂質(zhì)體12μl與無(wú)血清opti-MEM混勻后輕覆細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后換成含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)48 h，加入細(xì)胞蛋白裂解液RIPA（97．5%PBS、1% NP40、0．5%脫氧膽酸鈉、0．1%SDS）冰上裂解30 min，4℃離心取上清液，提取總蛋白（10μg／組）。經(jīng)10%SDS-PAGE膠分離后，電轉(zhuǎn)（200 mA、120 min）至PVDF膜上。膜用TBST（20 mmol／L Tris-HCl、pH 7．4，150 mmol／L NaCl，0．05%Tween 20）封閉，3 h后置于含抗 RunX2抗體（1：1 000）的TBST中4℃孵育過(guò)夜，再加入相應(yīng)結(jié)合的二抗后與ECL發(fā)光檢測(cè)劑結(jié)合顯示結(jié)果。

1．6細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)

1．6．1MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力將pcDNA3．1-RunX2真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，促使細(xì)胞中的RunX2表達(dá)上調(diào)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞活力的變化，常規(guī)的消化、計(jì)數(shù)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，并將細(xì)胞接種于96孔板中，按照每孔2 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種，每種細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別標(biāo)記為0、24、48 h，共3塊板，將96孔板放入培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，取0 h的96孔板，在避光條件下加入MTT溶液后繼續(xù)孵育，4 h后收取0 h的板，將上清液倒去，每孔加入DMSO溶解結(jié)晶，混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)550 nm處光密度（optical density，OD）值。第2天相同時(shí)間加MTT，收板后測(cè)OD值，以此類推。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1．6．2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞移動(dòng)能力的變化，取6孔板于生物安全柜內(nèi)操作，用直尺在每孔底部至少劃三條線作為標(biāo)記，然后消化對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)，每孔約3 ×105個(gè)細(xì)胞。將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞達(dá)到80%以上的融合率時(shí)，將細(xì)胞置于生物安全柜內(nèi)操作。用20μl白槍頭垂直于6孔板橫線劃痕，至少劃三道痕。用PBS輕洗去劃下的細(xì)胞，于相差顯微鏡下拍照，記為0 h。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h，在同一位置拍照，以觀察細(xì)胞的移動(dòng)情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1構(gòu)建人RunX2真核表達(dá)載體首先用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法得到RunX2的基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)一條1 kb左右的片段，見(jiàn)圖1。將上述1 kb左右的片段回收酶切后用T4 DNA連接酶鏈接于pcDNA3．1真核表達(dá)載體，鏈接產(chǎn)物做小規(guī)模細(xì)菌轉(zhuǎn)化，PCR及EcoRⅠ和SacⅡ雙酶切后經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)，見(jiàn)圖2。

2.2轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RunX2的細(xì)胞高表達(dá)RunX2

pcDNA3．1-RunX2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至低表達(dá) RunX2的MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RunX2高表達(dá)，由圖可以看出轉(zhuǎn)染組中的RunX2蛋白表達(dá)高于未轉(zhuǎn)染組。見(jiàn)圖3。

2.3RunX2促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的活力及移動(dòng)能力

將構(gòu)建好的pcDNA3．1-RunX2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后通過(guò)Western blot檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，見(jiàn)圖3。收集細(xì)胞，MTT法檢測(cè)其細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力明顯增加。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組增殖能力增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001），見(jiàn)圖4。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其移動(dòng)能力發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組的MCF-7細(xì)胞移動(dòng)能力明顯增加。與未轉(zhuǎn)染組相比，24 h劃痕內(nèi)遷移細(xì)胞數(shù)目明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），見(jiàn)圖5。

3　討論

RunX2不僅調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，而且與乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。RunX2通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)促發(fā)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。骨涎蛋白（BSP）與導(dǎo)管內(nèi)轉(zhuǎn)移性乳腺癌相關(guān)，可能在誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞定向骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用，骨橋蛋白（OPN）可以介導(dǎo)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中腫瘤細(xì)胞與骨組織表面的連接，并且與骨轉(zhuǎn)移中破骨細(xì)胞引發(fā)骨吸收活性增加相關(guān)。RunX2是骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)促進(jìn)溶骨作用、腫瘤血管新生等多個(gè)途徑轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［4-6］。RunX2已被證明在成骨與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用［7］。Runx2還被報(bào)道在臨床預(yù)后差的乳腺癌中高表達(dá)［8］。最近，McDonald et al［9［10-13］顯示，參與骨侵襲的幾個(gè)基因，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、VEGF、OPN和BSP都是通過(guò)RunX2調(diào)節(jié)的，表明這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能有助于乳腺腫瘤骨轉(zhuǎn)移。這與本實(shí)驗(yàn)中提到的RunX2沉默降低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力一致。此外，RunX2亦可調(diào)節(jié)MMPs家族中的其他基因，在MDA-MB-231中，利用小干擾RNA沉默RunX2表達(dá)可降低MMP-9的表達(dá)，并減弱癌細(xì)胞的侵襲能力，提示RunX2與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［14］。

RunX2在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制仍存爭(zhēng)議。但是，在RunX2所表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞株中，以上骨細(xì)胞分化效應(yīng)并未出現(xiàn)。研究［15］表明，在MDA-MB-231細(xì)胞株中，RunX2調(diào)節(jié) OPN基因的表達(dá)，并可持續(xù)激活BSP使其表達(dá)異常，抑制RunX2的表達(dá)可導(dǎo)致OPN和BSP的表達(dá)明顯下調(diào)，提示RunX2在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，RunX2能夠調(diào)節(jié)一系列基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，在乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起重要作用，且與其預(yù)后密切相關(guān)。

本研究構(gòu)建的RunX2真核表達(dá)載體通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，并通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞高表達(dá)RunX2，說(shuō)明成功構(gòu)建了pcDNA3．1-RunX2真核表達(dá)載體。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)RunX2促進(jìn)了細(xì)胞增殖，但是劃痕試驗(yàn)中，劃痕愈合是因?yàn)樵鲋炒龠M(jìn)劃痕愈合還是因?yàn)檫^(guò)表達(dá)RunX2促進(jìn)細(xì)胞遷移尚未明確，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Construction of RunX2 eukaryotic expression vector and study the proliferations and m igrations effective of RunX2 on breast cancer cells

Zhao Ming，F(xiàn)an Chulin，Guo Qiang，et al
（Dept of Pathophysiology，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the biology effectof RunX2 gene after constructing the eukaryotic expression vector of human RunX2 in breast cancer cells．MethodsBy the recombinant techniques such as PCR amplification，digestion，ligation，the human RunX2 gene was inserted into the eukaryotic expression vector of pcDNA3．1，and then itwas identified by restriction enzyme digestion，RT-PCR，sequencing．Eukaryotic expression vector of human RunX2 gene was transiently transfected into MCF-7 cells．Western blot analysis was applied to detect the expression of RunX2 protein in breast cancer cellsMCF-7；MTT assay and wound healing assaywere used to detect the cells proliferation and invasion of MCF-7．ResultsOur result showed that the eukaryotic expression vector of RunX2 was highly expressed RunX2 protein in MCF-7 cells，the cell proliferation and migration abilities were enhanced in MCF-7 cells with high expression of RunX2 protein．ConclusionRunX2 constructs eukaryotic expression vector and promotesmalignant behavior of breast cancer cells．

Key wordsRunX2；breast cancer

中圖分類號(hào)R 349．5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1593-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81302319）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，合肥230032

作者簡(jiǎn)介：趙明，男，碩士研究生；