黃晨晨，廖榮豐，汪　楓，唐松濤

糖尿病大鼠角膜上皮損傷修復(fù)過程中occludin的重塑特點

黃晨晨1，廖榮豐1，汪楓1，唐松濤2

摘要目的探討糖尿?。―M）大鼠和正常大鼠角膜上皮修復(fù)過程中緊密連接蛋白occludin重塑的特點。方法90只SD大鼠隨機分為DM組和正常對照組（NC）各45只（DM組均高脂喂養(yǎng)），通過腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)形成Ⅱ型DM大鼠模型，于損傷后0 h（未損傷），16、48、72、120 h（每組5只）處死大鼠取角膜。間接免疫熒光染色和Western blot法觀察occludin蛋白在損傷修復(fù)過程中的變化。結(jié)果DM大鼠角膜上皮損傷愈合率較NC組大鼠明顯延遲，DM組和NC組大鼠角膜上皮occludin蛋白在損傷后16、48 h表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），在損傷后0、72、120 h表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論糖尿病可影響大鼠角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)過程中緊密連接蛋白occludin蛋白的表達。

關(guān)鍵詞糖尿??；緊密連接蛋白；角膜上皮；免疫熒光染色；Western blot

2015-06-03接收

隨著社會的進步和發(fā)展，糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）的發(fā)病率也在快速的增加，糖尿病眼病也成為了致盲的主要原因［1］。研究［2］報道了糖尿病眼病的并發(fā)癥，除了糖尿病視網(wǎng)膜病變，多種類型的角膜上皮紊亂在糖尿病患者中也十分常見，包括角膜上皮損傷愈合的延遲，上皮屏障功能、基礎(chǔ)淚液分泌量和角膜敏感度的下降。其中，角膜上皮損傷修復(fù)延遲會導(dǎo)致糖尿病患者眼內(nèi)手術(shù)后的一系列臨床問題，尤其是玻璃體切除術(shù)后。雖然損傷修復(fù)延遲的機制尚未了解，但可能與緊密連接蛋白表達的變化有關(guān)。該實驗通過檢測去上皮后不同時間occludin蛋白的表達，探討DM大鼠和NC大鼠在角膜上皮修復(fù)過程中緊密連接蛋白occludin重塑特點。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物SPF級健康成年雄性SD大鼠90只購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體重200 g左右，發(fā)育正常，角膜透明，術(shù)前裂隙燈顯微鏡下眼部檢查均無異常。

1．1．2主要試劑鏈脲佐菌素（streptozotoein，STZ）購自美國Sigma公司；0．5%丙美卡因滴眼液購自美國愛爾康公司；兔抗occludin多克隆抗體購自美國Abcam公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、新生胎牛血清、抗熒光淬滅劑、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白Marker購自上海碧云天公司。

1．1．3主要儀器裂隙燈、手術(shù)顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；眼前節(jié)照相機（日本佳能公司）；血糖分析儀（美國強生公司）；冰凍切片機（德國Leica公司）；-80℃低溫冰箱（美國Thermo Forma公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；凝膠電泳成像系統(tǒng)（美國Kodak公司）；圖像分析軟件Quantity One（美國bio-rad公司）。

1．2方法

1．2．1動物分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為DM組（n＝45）和NC組（n＝45）。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±1）℃，濕度50%～60%。

1．2．2DM大鼠模型建立DM組大鼠由高脂飲食聯(lián)合一次性腹腔注射STZ（劑量為32 mg／kg）建立DM模型，NC組普通飲食注射等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。1周后尾靜脈采血檢測空腹血糖，血糖值大于11．1 mmol／L為造模成功，若造模未成功則小劑量補打1次，若動物死亡則立即補齊。造模成功后于每周早上同一時間空腹檢測血糖和體重。實驗過程均符合《實驗動物管理條例》的有關(guān)要求。

1．2．3角膜上皮損傷模型建立將DM大鼠和NC大鼠以0．3 ml／100 g劑量腹腔注射水合氯醛麻醉，同時采用0．1%鹽酸丙美卡因表面麻醉。以直徑4 mm的環(huán)鉆標(biāo)記角膜，用刀片夾持器夾取鈍刀片以不傷及角膜基質(zhì)層的深度去除標(biāo)記內(nèi)角膜上皮組織。術(shù)后以鹽酸金霉素涂眼，防止感染。

1．2．4角膜創(chuàng)傷愈合率觀察創(chuàng)傷模型建立后，隨機選取DM大鼠（n＝5）和NC大鼠（n＝5）進行角膜熒光素鈉染色并在裂隙燈顯微鏡下觀察在16 h及24 h時角膜上皮愈合情況并照相。用Image Pro Plus軟件分析照片并計算創(chuàng)傷面積。創(chuàng)面愈合率（%）＝［（原始創(chuàng)面面積-現(xiàn)創(chuàng)面面積）／原始創(chuàng)面面積］×100%。

1．2．5角膜標(biāo)本的制備于角膜損傷后0 h（未損傷），16、48、72、120 h以過量水合氯醛腹腔注射處死大鼠，每個時間點各5只，用PBS沖洗角膜，用手術(shù)剪去除眼球，用眼科剪沿角鞏膜緣剪下角膜，包埋于放有包埋劑（opti-mum cutting temperature compound，OCT）的24孔板中，-80℃冰箱保存。用于HE染色和免疫熒光染色分析。

1．2．6角膜冰凍切片及HE染色調(diào)節(jié)冰凍切片機的溫度為-20℃預(yù)冷一段時間后，取出-80℃冰箱保存的OCT埋的角膜標(biāo)本，調(diào)節(jié)切片厚度為6 μm進行切片，切片經(jīng)室溫干燥后，放入冰丙酮中浸泡10 min固定。稍水洗，蘇木精染色60℃，30～60 s，用流水沖洗蘇木精液，加1%的鹽酸乙醇后水洗，加促藍液反藍后用流水沖洗，再加0．5%伊紅染色液后蒸餾水稍洗，放入80%乙醇溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇溶液，再分別經(jīng)過石碳酸二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫水后，中性樹膠封片。光鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1．2．7免疫熒光染色取出上述丙酮固定后的角膜冰凍切片，室溫下待干燥后PBS沖洗3次，每次5 min，2%胎牛血清封閉1 h，加入1∶200兔抗occludin多克隆抗體（一抗），4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，避光加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗），常溫避光孵育1 h，PBS沖洗5次，每次5 min，加入抗熒光淬滅劑封片。用日本Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡觀察并拍照。

1．2．8Western blot檢測將-80℃保存的角膜組織取出加入600μl RIPA蛋白裂解液充分研磨成勻漿，4℃、12 000 r／min離心15 min，將離心后的上清液分裝轉(zhuǎn)移到0．5 m l離心管中，使用BCA法測定蛋白濃度。取20μl蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加一抗4℃冰箱孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，用ECL試劑盒進行顯影，以GAPDH為內(nèi)參，Quantity One軟件分析灰度值。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16．0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組資料的比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗。

2　結(jié)果

2.1NC大鼠與DM大鼠體重的比較在高脂喂養(yǎng)4周后（注射STZ之前）NC組大鼠平均體重（370 g）較DM大鼠（400 g）低7．5%（P＜0．01），但在第16周時DM大鼠的平均體重（410 g）較NC組大鼠（510 g）低19．6%（P＜0．01），見圖1A。

2.2NC大鼠與DM大鼠的血糖比較在高脂喂養(yǎng)4周后（注射STZ之前）NC組空腹血糖值約為4 mmol／L，DM組約為6 mmol／L（P＜0．05），但在第16周時DM大鼠的空腹血糖值約為20 mmol／L，NC的空腹血糖值仍為5 mmol／L（P＜0．01），見圖1B。

2．3角膜上皮損傷修復(fù)觀察隨機選取DM組與NC組大鼠各5只，損傷后24 h內(nèi)角膜熒光素鈉染色，裂隙燈下觀察上皮創(chuàng)傷修復(fù)情況。NC組在16 h 和24 h的損傷愈合率達55%和84%，而DM組在術(shù)后16 h和24 h的損傷愈合率為34%和56%，見表1。DM大鼠的角膜損傷愈合率較NC組大鼠有明顯的延遲（P＜0．01），見圖2。

表1　DM大鼠和　NC大鼠角膜上皮損傷愈合率比較（n＝5，±s）

表1　DM大鼠和　NC大鼠角膜上皮損傷愈合率比較（n＝5，±s）

組別　16 h（%）　24 h（%）　P值NC組55．84±4．15　84．08±3．34　0．001 DM組34．4±3．11　56．84±2．84　0．001

2.4HE染色觀察大鼠角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)過程的變化在角膜上皮去除術(shù)前可以觀察到NC組大鼠的角膜上皮的多層上皮細胞，在16、48 h可以觀察到單層或多層角膜上皮細胞覆蓋在缺損表面的邊緣，72 h角膜上皮的重建已經(jīng)完成。但在角膜上皮去除術(shù)前可以觀察到DM大鼠的角膜上皮基底細胞和基質(zhì)層水腫，16 h缺損表面仍沒有被覆蓋，在48、72 h可以觀察到較NC組覆蓋在上皮缺損處的角膜上皮細胞少且不規(guī)則，見圖3。

2.5occludin蛋白免疫熒光結(jié)果免疫熒光檢測角膜上皮發(fā)現(xiàn)occludin蛋白分布在表層角膜上皮細胞的邊緣。角膜上皮未去除時DM組和NC組之間未觀察到有明顯差異。角膜上皮去除16 h可以觀察到DM組角膜上皮occludin表達較NC組明顯更弱，且排列不規(guī)則。角膜上皮去除48 h可以觀察到DM角膜上皮occludin的表達較DM組16 h明顯增強，排列也更規(guī)則，但仍比48 h的NC組occludin的表達低。角膜上皮去除72 h，兩組occludin的表達都更規(guī)則與未受傷時無明顯差別。在角膜上皮去除120 h，兩組間未觀察到明顯區(qū)別，見圖4。

2.6Western bolt結(jié)果觀察未損傷大鼠的角膜上皮occludin的表達顯示NC組和 DM組之間的表達量無明顯差異（P＞0．05）。在角膜上皮去除術(shù)16、48 h觀察到DM組大鼠的角膜上皮occludin表達量明顯低于NC組（P＜0．05）。在角膜上皮去除72、120 h組大鼠的occludin表達量無明顯差異（P ＞0．05），見圖5。

3　討論

Ⅱ型糖尿病會導(dǎo)致各種眼部并發(fā)癥，其中最常見的并發(fā)癥為糖尿病視網(wǎng)膜病變［3］，但是糖尿病角膜病變?nèi)缃悄?、角膜炎，以及各種角膜上皮缺損也被大量報道過。有報道表示有50%甚至是超過50%的糖尿病患者正在遭受糖尿病角膜病的危害［4］。

角膜上皮具有屏障功能，能夠保護眼睛不受外界環(huán)境的影響?；加刑悄虿〗悄げ〉奶悄虿』颊叩慕悄るm然看起來仍然是透明的并且在沒有角膜損傷時看起來也是正常的，然而角膜上皮一旦損傷就會發(fā)現(xiàn)正常的分層結(jié)構(gòu)的上皮的重建推遲了［5］。損傷面積的修復(fù)并不能代表上皮屏障功能的重建。大量的研究［6］顯示上皮屏障功能的重建慢于上皮損傷的愈合。所以眼部手術(shù)后細胞間連接的重建對于上皮的損傷修復(fù)非常重要。

緊密連接蛋白occludin分子質(zhì)量為65 ku，也是第一個被認定為緊密連接元件的蛋白，屬于跨膜蛋白家族，具有兩種不同的亞型，廣泛表達于上皮細胞層中，與ZO蛋白和claudin蛋白等構(gòu)成緊密連接的基本結(jié)構(gòu)，是上皮屏障功能的基礎(chǔ)。

早期的緊密連接蛋白的重建對防止外環(huán)境中的有害物質(zhì)通過細胞間隙進入內(nèi)環(huán)境起到重要的作用。通過以往的研究可以知道，緊密連接蛋白大多表達在角膜上皮表面細胞層［7］。occludin蛋白是緊密連接蛋白的一種，其表達在角膜的表層上皮細胞層中。

本研究檢測了上皮去除術(shù)后上皮損傷修復(fù)的愈合率發(fā)現(xiàn)在上皮去除16 h和24 h時NC組大鼠的角膜愈合率是 DM組大鼠愈合率的1．5倍。這與Fukushi et al［8］的研究結(jié)果一致，DM大鼠在角膜上皮去除術(shù)后上皮的愈合率延遲。實驗通過免疫熒光染色法發(fā)現(xiàn)在未損傷的DM大鼠角膜中緊密連接蛋白occludin沒有明顯的變化。但是DM大鼠角膜在損傷后的早期occludin蛋白的表達量較NC組更低也更弱，并且DM大鼠的角膜上皮緊密連接蛋白的重建較NC組的更慢。而在損傷后期DM組大鼠與NC組大鼠的緊密連接蛋白的表達量并無顯著的區(qū)別。Western blot也同樣發(fā)現(xiàn)在未損傷的DM大鼠角膜中緊密連接蛋白occludin沒有變化，DM大鼠損傷早期occludin蛋白的表達量、緊密連接蛋白的重建更弱且更慢，損傷后期緊密連接蛋白的表達量無明顯區(qū)別。這些結(jié)果顯示DM大鼠角膜上皮損傷修復(fù)過程中緊密連接蛋白的重建推遲了，但并沒有缺失。

持續(xù)12周的高糖狀態(tài)未見糖尿病大鼠角膜上皮緊密連接蛋白的明顯改變但是導(dǎo)致了角膜上皮損傷過程早期緊密連接蛋白重建的推遲。

糖尿病患者角膜上皮損傷愈合的延遲是一個常見但難以解決的問題，科學(xué)研究者對這一問題也做了大量的研究，而從緊密連接蛋白在上皮的損傷愈合中的重塑的角度探索這一問題是一個全新的角度，需要全面的深入研究緊密連接蛋白在糖尿病角膜上皮損傷愈合過程中起到的重要作用。

參考文獻

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Characteristics of reconstituted tight junctions after corneal epithelial wounds in diabetic rats

Huang Chenchen，Liao Rongfeng，Wang Feng，et al
（Dept of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate the characteristics of reconstituted tight junctions after corneal epithelial wounds in a high-fat diet combined with streptozocin（STZ）-induced ratmodel of type 2 diabetesmellitus（DM）．MethodsNinety Sprague-Dawleymale ratswere randomly divided into diabetic and normal control groups（n＝45 each）．A high-fat diet combined with intraperitoneal STZ injection was used to induce type 2 DM．Diabetic and healthy ratswere sacrificed before debridementand 16，48，72，and 120 hours afterwards forWestern blotand immunofluorescence．Resu ltsCorneal epithelial wound closure rates were decreased in diabetic rats compared with the normal rats．Immunofluorescence and Western blot analysis demonstrated thatoccludin expression in the corneal epithelium of the diabetic group wasweaker compared to the normal group at the 16 and 48 hour time-points after debridement．ConclusionAbnormal occludin expressionmay contribute to delayed epithelialwound healing in diabetic corneas．

Key wordsdiabetesmellitus；tight junction；corneal epithelium；immunofluorescence staining；Western blot

中圖分類號R 772．2

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1583-05

基金項目：安徽省自然科學(xué)基金（編號：1408085MH191）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1眼科、2內(nèi)分泌科，合肥230032

作者簡介：黃晨晨，女，碩士研究生；廖榮豐，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：liaorfayfy ＠126．com