馮　迪，郭　欣，梅曉冬

N-乙酰半胱氨酸對(duì)香煙暴露小鼠肺組織中IL-17A及IL-22的影響

馮迪，郭欣，梅曉冬

摘要目的探討香煙暴露誘導(dǎo)的肺氣腫小鼠肺組織中白介素-17A（IL-17A）以及白介素-22（IL-22）的變化以及戒煙、N-乙酰半胱氨酸（NAC）對(duì)IL-17A和IL-22的影響。方法采用香煙暴露法建立小鼠肺氣腫模型，給予戒煙及NAC灌胃干預(yù)。采用ELISA法檢測(cè)肺勻漿及肺泡灌洗液（BALF）中IL-17A和IL-22濃度。HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化。結(jié)果香煙暴露可使小鼠肺組織發(fā)生肺氣腫樣變化。與正常對(duì)照組相比，肺勻漿及BALF中，香煙暴露后IL-17A及IL-22水平升高（P＜0．05）。與香煙暴露組比較，戒煙及NAC灌胃后IL-17A及IL-22水平下降（P＜0．05）。肺勻漿及BALF中IL-22與IL-17A的比值逐漸降低。結(jié)論IL-17A及IL-22與香煙暴露導(dǎo)致的小鼠肺組織中慢性炎癥的發(fā)生有關(guān)。戒煙及NAC處理對(duì)吸煙導(dǎo)致的IL-17A及IL-22變化有一定干預(yù)作用。

關(guān)鍵詞香煙暴露；N-乙酰半胱氨酸；白介素-17A；白介素-22

2015-08-10接收

梅曉冬，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hfmxd＠sina．com

慢性阻塞性肺疾?。璺危┦且唤M以不完全可逆氣流受限為特征的疾病，主要病理變化包括慢性氣道炎癥和肺氣腫。影響慢阻肺發(fā)生發(fā)展的因素十分復(fù)雜，與顆粒物質(zhì)吸入、遺傳基因、性別、社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況等因素均有關(guān)。吸煙是已知的慢阻肺發(fā)病的主要病因之一。近年來(lái)研究［1-4］表明白介素-17（interleukin-17，IL-17）和白介素-22（interleukin-22，IL-22）在慢阻肺的發(fā)病中起重要作用，是慢阻肺病理變化發(fā)生的重要細(xì)胞因子。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種硫醇類抗氧化劑，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種藥理效應(yīng)，其在治療慢阻肺中的作用機(jī)制目前尚未完全闡明，在慢阻肺炎癥免疫機(jī)制中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用也不清楚。臨床研究［5］顯示NAC對(duì)慢阻肺有一定治療效果。該研究通過(guò)吸煙制作小鼠肺氣腫模型，予以戒煙和使用NAC治療，觀察小鼠肺勻漿及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中IL-17A及IL-22的變化，探討NAC對(duì)小鼠肺中IL-17A及IL-22相關(guān)機(jī)制的干預(yù)影響。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性BABL／c小鼠，清潔級(jí)，10周齡，20～27 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在恒溫（25°C），光照：黑暗周期12 h∶12 h環(huán)境中飼養(yǎng)適應(yīng)1周后實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1．1．2藥品與試劑紅三環(huán)牌香煙（安徽紅三環(huán)工業(yè)公司，焦油量為11 mg／支，煙堿量為0．8 mg／支，一氧化碳量為15 mg／支）；NAC（A7250，美國(guó)Sigma公司）；IL-17A、IL-22 ELISA試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)：23017968、23023883，上海裕平公司）。

1．1．3儀器與設(shè)備自制香煙暴露帶孔玻璃倉(cāng)；JT12001電子天平（上海精天電子儀器廠）；KDC-2046低速冷凍離心機(jī)（中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；高速勻漿器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）；恒溫儀（上海卓一電子有限公司）；酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；BI2000生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1．2方法

1．2．1動(dòng)物模型的建立將BABL／c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、香煙暴露組、戒煙4周組、戒煙8周組、戒煙12周組、NAC灌胃4周組、NAC灌胃8周組、NAC灌胃12周組，每組5只。正常對(duì)照組不給予任何干預(yù)措施，自由攝食飲水。香煙暴露組、戒煙組及NAC灌胃組置香煙暴露玻璃倉(cāng)內(nèi)給予香煙煙霧暴露，同時(shí)點(diǎn)燃4支香煙，放入倉(cāng)內(nèi)自然燃燒，待燃燒完畢煙霧基本消失（約20 min）后，打開(kāi)倉(cāng)蓋，休息30 min后重復(fù)上述操作3次。每周5 d，持續(xù)24周，肺氣腫模型造模結(jié)束。將正常對(duì)照組及香煙暴露組小鼠處死采樣。戒煙4周組停止香煙暴露，繼續(xù)飼養(yǎng)4周后處死采樣。戒煙8周組繼續(xù)飼養(yǎng)8周處死采樣，戒煙12周組繼續(xù)飼養(yǎng)12周處死采樣，飼養(yǎng)方法同正常對(duì)照組。NAC灌胃4周組停止香煙暴露，并給予NAC 100 mg／kg灌胃，每天1次，每周5 d，4周后處死采樣。NAC灌胃8周組8周后處死采樣，NAC灌胃12周組12周后處死采樣。

1．2．2標(biāo)本采集小鼠最后一次香煙暴露或者給藥24 h后，給予硫噴妥鈉腹腔注射麻醉，立即解剖暴露氣管，取出右肺，置入10%甲醛內(nèi)固定，留作病理觀察。左肺行氣管插管后予以冷0．9%鹽水以0．4、0．3、0．3 ml分3次氣管內(nèi)灌入，每次反復(fù)抽吸3次后回收，回收率60%～70%。回收后的 BALF 在4°C條件下，3 000 r／min離心10 min，取上清液分裝后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。離斷灌洗后的左肺，稱取重量，按1∶5的量，加冷生理鹽水，冰上充分研磨，成漿后4℃、3 000 r／min離心10 min，取上清液分裝置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3病理切片制作將固定好的肺組織石蠟包埋切片，行HE染色，每只小鼠制作3張切片，每個(gè)切片任取5個(gè)視野，光學(xué)顯微鏡下（10×10）觀察肺組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化，參照文獻(xiàn)［6-7］測(cè)量平均肺泡壁內(nèi)襯間隔（linear intercept，Lm）及損傷指數(shù)（destructive index，DI）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1．2．4ELISA法檢測(cè)IL-17A、IL-22濃度按照ELISA試劑盒提供的使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)BALF及肺勻漿中IL-17A、IL-22的濃度。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間兩兩比較采用單因素方差分析及兩兩比較的SNK法。采用Graphpad Prism 5軟件作圖。

2　結(jié)果

2．1形態(tài)學(xué)變化光鏡下，正常對(duì)照組小鼠肺泡壁完整、連續(xù)、肺泡大小較均一。各實(shí)驗(yàn)組（香煙暴露組、戒煙組及NAC灌胃組）小鼠肺泡壁顯著變薄、斷裂，肺泡腔擴(kuò)大、大小不一，肺泡Lm、DI明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2．94、3．60，P＜0．05），各實(shí)驗(yàn)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠平均肺泡　Lm及　DI比較（±s）

表1　各組小鼠平均肺泡　Lm及　DI比較（±s）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0．05

組別　Lm（μm）DI正常對(duì)照30．25±4．11　29．25±5．50香煙暴露　48．60±7．60*　47．80±8．14*戒煙　4周　45．25±5．80*　52．50±9．33*戒煙　8周　45．25±9．67*　52．00±6．58*戒煙12周　41．40±5．86*　46．60±6．19*NAC 4周　45．40±5．86*　49．40±8．71*NAC 8周　43．60±8．02*　46．40±9．29*NAC12周　46．40±5．64*　46．00±6．86*

2.2肺勻漿及 BALF中 IL-17A的變化與正常對(duì)照組比較，香煙暴露后小鼠肺勻漿中IL-17A水平顯著升高；戒煙4周后IL-17A水平雖有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。戒煙8周、12周、NAC灌胃各組IL-17A水平與香煙暴露組相比，均明顯下降（P＜0．05），與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與戒煙4周相比，NAC灌胃4周組IL-17A水平明顯下降，見(jiàn)圖1A。與正常對(duì)照組比較，香煙暴露后，小鼠BALF中IL-17A水平明顯升高。同樣，戒煙4周對(duì)升高的IL-17A無(wú)顯著影響。戒煙8周及NAC灌胃4、8周組IL-17A水平仍高于正常對(duì)照組。戒煙12周及NAC灌胃12周后IL-17A濃度降至正常對(duì)照組水平。與戒煙4周相比，NAC灌胃 4周組IL-17A水平明顯下降，見(jiàn)圖1B。

2.3肺勻漿及BALF中IL-22的變化香煙暴露后小鼠肺勻漿中IL-22水平明顯升高。戒煙4、8周后，IL-22水平有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與香煙暴露組比較，戒煙12周及NAC灌胃各組IL-22值均顯著降低；此4組與正常對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與戒煙4周相比，NAC灌胃4周組IL-22水平明顯下降，見(jiàn)圖2A。BALF中，香煙暴露組、戒煙各組及NAC灌胃4、8周組IL-22水平較正常對(duì)照組均升高，僅NAC灌胃12周組IL-22水平下降至正常對(duì)照組水平。除戒煙4周組外，其余各處理組IL-22水平均較香煙暴露組降低。與戒煙4周相比，NAC灌胃4周組IL-22水平明顯下降，見(jiàn)圖2B。

2.4肺勻漿及BALF中IL-22與IL-17A比值的變化肺勻漿及BALF中，隨著戒煙及NAC灌胃干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-22與IL-17A的比值不斷下降，見(jiàn)圖3。

3　討論

IL-17家族包括IL-17A～F、IL-21、IL-22，目前研究最多的主要為IL-17A和IL-22。多種免疫細(xì)胞可分泌IL-17和IL-22，其中Th17是IL-17及IL-22的主要來(lái)源細(xì)胞［8-9］。此外，Th22亦可分泌大量IL-22［10］。近年研究［11-12］表明IL-17和IL-22增高與多種慢性炎癥疾病如類風(fēng)濕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病發(fā)病有關(guān)?？?IL-17和抗-IL-22抗體治療能夠在一定程度上改善病情，提示IL-17、IL-22可促進(jìn)這些自身免疫性疾病的發(fā)生。

IL-17及IL-22是慢阻肺發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞因子。本研究顯示香煙暴露后，小鼠肺勻漿及BALF中IL-17A濃度升高，與蒙菁菁等［3］的報(bào)道一致。小鼠受到香煙煙霧刺激后，Th17等多種炎癥細(xì)胞募集于氣道，產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，這可能是IL-17A增加的直接原因。隨著戒煙時(shí)間的延長(zhǎng)，氣道受到的煙霧刺激逐漸減少，募集的炎癥細(xì)胞亦逐漸減少，因而IL-17A等細(xì)胞因子的分泌逐漸減少。與Li et al［4］的研究結(jié)果類似，本實(shí)驗(yàn)香煙暴露后，小鼠BALF中IL-22升高。同樣，這與Th17、Th22細(xì)胞浸潤(rùn)氣道，導(dǎo)致IL-22分泌增多有著密切關(guān)系。戒煙4周、8周、12周后，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)漸減少，繼之產(chǎn)生的IL-22亦逐漸減少。

NAC是一種含有巰基（-SH）的還原性物質(zhì)，為還原性谷胱甘肽的前體。除抗氧化作用外，NAC還有一定的抗炎作用。臨床研究［13］顯示口服NAC能夠顯著提高慢阻肺患者的用力呼吸流速，減少慢阻肺急性加重及患者住院的次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，NAC灌胃后小鼠肺組織中升高的IL-17A、IL-22水平明顯降低，可能與NAC抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、氣道炎癥得以控制有關(guān)。值得注意的是，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，IL-17A、IL-22水平有逐漸下降的趨勢(shì)；與同期戒煙組比較，NAC灌胃各組IL-17A、IL-22水平均低于戒煙組，即戒煙同時(shí)予以 NAC治療，就減少炎癥因子而言，其療效優(yōu)于單純戒煙。

IL-17和IL-22不僅來(lái)源細(xì)胞相似，而且兩者在多數(shù)免疫炎癥反應(yīng)中呈現(xiàn)同增同減的趨勢(shì)［14］。本實(shí)驗(yàn)顯示，香煙暴露后小鼠肺組織中IL-17A和IL-22表達(dá)均明顯增加，戒煙及NAC灌胃后二者均又明顯減少。隨著香煙暴露、戒煙和NAC干預(yù)時(shí)間的增加，肺勻漿和BALF中，IL-22及IL-17A濃度變化程度不同，兩者比例逐漸減小。提示IL-17A與IL-22這兩種細(xì)胞因子在吸煙導(dǎo)致慢性肺部炎癥的發(fā)病機(jī)制中，不同階段作用可能有所不同。據(jù)此推測(cè)這與IL-17A抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-22，從而使兩者比值減少有關(guān)［15］。此現(xiàn)象的意義及兩者之間相互影響的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示IL-17A和IL-22參與吸煙導(dǎo)致的肺部炎癥的發(fā)生。戒煙能夠使煙熏小鼠的慢性氣道炎癥明顯減輕，增高的IL-17A和IL-22顯著降低，但不能完全恢復(fù)至正常水平。NAC能夠明顯減輕吸煙導(dǎo)致的氣道炎癥，進(jìn)一步改善戒煙后小鼠肺部的炎癥變化。IL-17A和IL-22相關(guān)的免疫在慢阻肺的發(fā)病機(jī)制中的作用值得深入研究。

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Changes of interleukin-17A and interleukin-22 in the lung of cigarette smoke exposed m ice and the effect of N-acetylcysteine

Feng Di，Guo Xin，Mei Xiaodong

AbstractObjectiveTo investigate the changes of interleukin-17A（IL-17A）and interleukin-22（IL-22）in the lung of cigarette smoke exposedmice and the effectof smoking cessation and N-acetylcysteine（NAC）treatment．MethodsBALB／c mice in experimental groups were exposed to cigarette smoke．Then the smoke-exposure was stopped andmicewere treated with NAC gavage．Themicewere executed 1，2，and 3 months after smoking cessation．Lung tissue sample and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were collected．HE staining was used to observe the pathologic changes of the lung and ELISA was used tomeasure the level of IL-17A and IL-22．Resu ltsConsiderable emphysematous changes was found in the lung ofmice exposed to cigarette smoke．Compared with the controls，the level of IL-17A and IL-22 elevated remarkably in pulmonary tissue and BALF after smoking exposure and declined gradually after smoking cessation．Additional NAC gavage treatment enhanced the decline tendency．ConclusionIL-17A and IL-22 might play a complex role in the chronic inflammatory changes of lung in mice exposed to cigarette smoke．

Key wordscigarette smoking；N-acetylcysteine；interleukin-17A；interleukin-22

中圖分類號(hào)R 563．3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1579-05

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085MH115）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥230001

作者簡(jiǎn)介：馮迪，女，碩士研究生；