胡媛媛，徐元宏，沈繼龍，陳　鶴

血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶誘導(dǎo)Th2免疫偏移的研究

胡媛媛1，徐元宏1，沈繼龍2，陳鶴2

摘要目的分析日本血吸蟲感染以及蟲源性糖蛋白果糖二磷酸醛縮酶（SjFBPA）刺激后小鼠脾臟細(xì)胞中白介素4 （IL-4）、白細(xì)胞分化抗原CD8a因子表達(dá)量的動態(tài)變化，并探討SjFBPA與輔助型T細(xì)胞（Th2）免疫應(yīng)答的關(guān)系。方法血吸蟲尾蚴感染C57小鼠10只，設(shè)正常對照組。感染8周后處死小鼠，取脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液；用藻紅蛋白（PE）標(biāo)記CD8a抗體，藻青蛋白（APC）標(biāo)記IL-4抗體進(jìn)行細(xì)胞染色；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子表達(dá)量的變化。10只正常C57小鼠處死后取脾臟制成淋巴細(xì)胞懸液，加SjFBPA蛋白體外刺激，按上述流程刺激方法檢測細(xì)胞。結(jié)果小鼠感染血吸蟲8周后脾細(xì)胞中IL-4、CD8a的表達(dá)量分別為（22．39± 5．93）%、（11．34±2．15）%，正常對照組脾細(xì)胞中IL-4、CD8a的表達(dá)量分別為（1．39±0．52）%、（1．98±0．84）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。SjFBPA體外刺激小鼠脾細(xì)胞的IL-4、CD8a的表達(dá)量分別為（14．14±1．16）%、（8．99± 0．81）%，正常對照組脾細(xì)胞中IL-4、CD8a的表達(dá)量分別為（1．86±0．93）%、（1．69±0．56）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)論SjFBPA在血吸蟲感染中具有誘導(dǎo)Th2免疫偏移的作用，樹突狀細(xì)胞作為提呈細(xì)胞參與該免疫反應(yīng)。

關(guān)鍵詞日本血吸蟲；蟲源性糖蛋白果糖二磷酸醛縮酶；Th2型免疫應(yīng)答

2015-07-31接收

2安徽人畜共患病研究所，合肥230032

徐元宏，男，教授，主任技師，博士生導(dǎo)師，E-mail：xyhong1964＠163．com

血吸蟲病是一種由蟲卵肉芽腫引起的慢性免疫性疾病，嚴(yán)重危害人類健康，全球大約有2億人感染血吸蟲，其中1．2億人有典型癥狀［1］。其病理基礎(chǔ)是沉積于組織中成熟蟲卵內(nèi)毛蚴分泌的可溶性蟲卵抗原（soluble eggs antigen，SEA），誘發(fā)宿主發(fā)生免疫應(yīng)答后形成蟲卵肉芽腫。血吸蟲感染早期以1型輔助T細(xì)胞（T helper cells，Th1）反應(yīng)為主；血吸蟲尾蚴感染6周時雌蟲開始產(chǎn)卵，宿主出現(xiàn)以Th2型細(xì)胞反應(yīng)為主的優(yōu)勢應(yīng)答，體內(nèi)Th2型細(xì)胞因子分泌增多。第8～9周后，Th2應(yīng)答達(dá)到高峰，此后Th1 和Th2型細(xì)胞因子分泌水平均有所下降；第12周后蟲卵內(nèi)毛蚴死亡，SEA逐漸減少至消失，肉芽腫體積減小，形成局部纖維化。發(fā)生Th1型向Th2型的免疫偏移。蟲源性糖蛋白果糖二磷酸醛縮酶（schistosome fructose bisphosphate aldolase，SjFBPA）是糖代謝中重要的糖裂解酶，參與寄生蟲能量的產(chǎn)生，對寄生蟲的生存和活動至關(guān)重要［2］。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是一種專職抗原提呈細(xì)胞，在激活T、B細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)及免疫耐受中均起著重要作用［3］。成熟DC激活T細(xì)胞能力很強(qiáng)，主要誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。該研究探討 SjFBPA對 Th2免疫偏移的影響以及作用途徑。

1　材料與方法

1．1動物與蛋白日本血吸蟲感染釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所，常規(guī)方法逸出尾蚴，用于感染小鼠。20只健康C57小鼠購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，6～8周齡，雄性，在清潔級環(huán)境下喂養(yǎng)。

1．2試劑DMEM培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品；新生及胎牛血清為杭州天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；青霉素鈉及硫酸鏈霉素、FITC標(biāo)記CD4抗體、APC標(biāo)記IL-4抗體、PE標(biāo)記的CD8a抗體均來自美國Sigma公司。

1．3方法

1．3．1血吸蟲感染小鼠將20只小鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只，一組經(jīng)腹部感染日本血吸蟲尾蚴15條，另一組作為空白對照組。于感染第8周后處死小鼠并制備脾單細(xì)胞懸液，PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5× 106個／m l。

1．3．2SjFBPA蛋白純化用實驗室保存的菌種進(jìn)行搖菌擴(kuò)增，觀察菌液光密度值（optical density，OD）大于0．6后加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，8 h后收集菌液超聲破碎離心取上清液進(jìn)行層析純化，純化后取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析鑒定及凝膠定量軟件quantityone純度測量，其余蛋白放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．3FBPA蛋白刺激取正常小鼠脫臼處死，取脾臟制備脾單細(xì)胞懸液，PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106個／m l。加入12孔板中，純化FBPA蛋白，每孔分別加1μg LPS＋1μg FBPA，37℃ CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)24 h。

1．3．4細(xì)胞染色將處理完的脾細(xì)胞懸液經(jīng)1 800 r／min離心10 min棄上清液后收集進(jìn)流式管中，相同條件處理的脾臟細(xì)胞分為兩批，一批每管加入1 μl FITC標(biāo)記的CD4抗體，4℃避光20 min，用500 μl Stain Buffer洗滌兩次后做打孔破膜處理：每管加100μl破膜液，4℃避光20 min，再加入APC標(biāo)記IL-4抗體，Wash Buffer洗滌兩次，加入500μl Stain Buffer后等待上機(jī)測量；另一批每管分別加入1μl FITC標(biāo)記的CD11c抗體、PE標(biāo)記的CD8a抗體4℃避光20 min后，Wash Buffer洗滌兩次，加入500μl Stain Buffer后等待上機(jī)測量。

1．3．5流式細(xì)胞儀檢測先根椐物理參數(shù)設(shè)活細(xì)胞門，然后以CD4設(shè)定CD4＋T細(xì)胞亞群，檢測CD4＋T細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子的表達(dá)率。再選出Lin-CD11c＋細(xì)胞，進(jìn)一步分析這群 Lin-CD11c＋細(xì)胞中CD8α表達(dá)情況。每次檢測前均用熒光微球?qū)α魇郊?xì)胞儀進(jìn)行光路和流路質(zhì)控監(jiān)測，保證儀器處于正常的工作狀態(tài)。

1．4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，組間比較采用t檢驗。

2　結(jié)果

2.1FBPA蛋白純化以及濃度測定12%SDSPAGE凝膠分析圖及quantityone對凝膠圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示目的蛋白相對含量為92%。見圖1。

2.2FBPA蛋白刺激小鼠脾臟細(xì)胞懸液后IL-4的表達(dá)量與正常脾臟細(xì)胞懸液的對比正常對照組的小鼠脾臟細(xì)胞懸液中IL-4的表達(dá)量為（1．86± 0．93）%，而FBPA刺激后的小鼠脾臟細(xì)胞懸液中IL-4的表達(dá)量為（14．14±1．16）%，F(xiàn)BPA刺激后的細(xì)胞因子IL-4表達(dá)量明顯增多（t＝38．165，P＜0．01），提示出現(xiàn)Th2免疫偏移特征。見圖2。

2.3血吸蟲感染8周后小鼠脾臟細(xì)胞懸液的IL-4的表達(dá)量與正常脾臟細(xì)胞懸液的對比正常脾臟細(xì)胞懸液的IL-4的表達(dá)量為（1．39±0．52）%，血吸蟲感染8周后小鼠脾臟細(xì)胞懸液中IL-4的表達(dá)量為（22．39±5．93）%。血吸蟲感染后8周的IL-4表達(dá)量明顯變化（t＝8．878，P＜0．01），提示已經(jīng)呈Th2免疫偏移。見圖3。

2.4不同處理組小鼠脾臟細(xì)胞懸液中IL-4的含量百分比的對比正常脾臟細(xì)胞懸液的IL-4含量百分比較低，而血吸蟲感染8周后以及用FBPA刺激后的小鼠脾臟細(xì)胞懸液中IL-4含量百分比明顯升高，并且血吸蟲感染8周比FBPA單一蛋白刺激的效果更為明顯。見圖4。

2.5FBPA蛋白刺激小鼠脾臟細(xì)胞懸液后CD8a的表達(dá)量與正常脾臟細(xì)胞懸液的對比正常脾臟細(xì)胞懸液的CD8a的表達(dá)量為（1．69±0．56）%，F(xiàn)BPA蛋白刺激小鼠脾臟細(xì)胞懸液后的CD8a的表達(dá)量為（8．99±0．81）%。FBPA蛋白刺激的細(xì)胞因子CD8a表達(dá)量明顯變化（t＝15．695，P＜0．01），提示參與提呈作用的DC細(xì)胞活化增多。見圖5。

2.6血吸蟲感染8周后小鼠脾臟細(xì)胞懸液的CD8a的表達(dá)量與正常脾臟細(xì)胞懸液的對比正常脾臟細(xì)胞懸液的CD8a的表達(dá)量為（1．98± 0．84）%，血吸蟲感染8周后小鼠脾臟細(xì)胞懸液的CD8a的表達(dá)量為（11．34±2．15）%。血吸蟲感染后8周的細(xì)胞因子CD8a表達(dá)量明顯變化（t＝10．511，P＜0．01），提示參與提呈作用的DC細(xì)胞活化增多。見圖6。

2.7不同處理組小鼠脾臟細(xì)胞懸液中CD8a＋的含量百分比的對比正常對照組脾臟細(xì)胞懸液的CD8a＋含量百分比較低，而血吸蟲感染8周后以及用FBPA刺激后的小鼠脾臟細(xì)胞懸液中CD8a＋含量百分比明顯升高，由于血吸蟲感染是綜合作用，相比FBPA單一蛋白刺激的效果更為明顯。見圖7。

3　討論

蠕蟲感染誘導(dǎo)的宿主Th2免疫偏移已成為感染免疫調(diào)節(jié)研究的重要模型。研究［4-6］顯示，血吸蟲對Th1介導(dǎo)的自身免疫性疾病和Th2介導(dǎo)的過敏癥均有抑制作用，有研究［7］表明Th2優(yōu)勢應(yīng)答出現(xiàn)在雌蟲產(chǎn)卵后，因此有研究者認(rèn)為，蟲卵是誘導(dǎo)Th2應(yīng)答的主要成分。但是，曼氏血吸蟲感染4周（尚未產(chǎn)卵）即出現(xiàn)Th2應(yīng)答，單性尾蚴感染也可激發(fā)Th2優(yōu)勢應(yīng)答［8］。提示單個蟲體表膜和分泌排泄抗原（ESA）中的糖脂以及糖蛋白可能是促進(jìn)Th2免疫偏移的主要誘導(dǎo)分子。成熟DC激活T細(xì)胞能力很強(qiáng)，主要誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，而不成熟DC可誘導(dǎo)免疫耐受。近年來又提出了DC1和DC2的亞類分類的概念，認(rèn)為DC1為髓系來源的DC，表達(dá)髓系標(biāo)志，主要誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答；DC2為淋巴系來源的DC，表達(dá)淋巴系的表面標(biāo)志如CD8分子（CD8a），具有誘導(dǎo)Th2型應(yīng)答，參與免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受的功能，在小鼠實驗中表達(dá)淋巴系表面分子CD8α的DC細(xì)胞被認(rèn)為是 DC2。本實驗中SjFBPA體外刺激小鼠脾臟細(xì)胞后引起的IL-4含量的變化顯示出Th2免疫應(yīng)答的特點，和血吸蟲感染小鼠后8周脾臟細(xì)胞因子的變化特點相同，同時血吸蟲感染小鼠8周后的DC細(xì)胞中表達(dá)CD8a＋的細(xì)胞數(shù)也有一定的增加，F(xiàn)BPA蛋白刺激后的小鼠脾臟細(xì)胞中的DC細(xì)胞中表達(dá)CD8a＋的細(xì)胞數(shù)也呈相同幅度的增加。

綜上所述，SjFBPA通過DC細(xì)胞介導(dǎo)在血吸蟲感染后誘導(dǎo)的Th2免疫偏移中起到重要作用，對揭示蟲體免疫逃避、宿主免疫耐受、免疫偏移、免疫病理以及疫苗“失能”的分子機(jī)制有重要的指導(dǎo)意義。

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A novel research of Th2 imm une deviation induced by SjFBPA

Hu Yuanyuan1，Xu Yuanhong1，Shen Jilong2，etal
（1Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022；2Anhui Institute of Human and Animal Diseases，Hefei230032）

AbstractOb jectiveTo analyze the dynamics of IL-4，CD8a in spleen cells of mice infected with cercariae of Schistosoma japonicum or SjFBPA and investigate the relationship between SjFBPA and the Th2-dominant response．Methods10 mice were infected by cercariae and 10 mice were uninfected．8 weeks after infection，allmice were sacrificed．Spleen single cell suspension was prepared and analyzed by flowed cytometry．Analysis was performed on the IL-4，CD8a cells of spleen cells stained with anti FITC-CD4，PE-CD8a，APC-IL-4 monoclonal antibody．Resu ltsAt 8 weeks，the percentage of IL-4 and CD8a cells in infected with cercariae of Schistosoma japonicum mice was 24．5%and 7．65%，respectively，while the percentage of IL-4 and CD8a cells in uninfected mice was1．18% and 0．571%，indicating a gradual decline（P＜0．05）．The percentage of IL-4 and CD8a cells in infected with SjFBPA was 18．3%and 5．82%，the percentage of IL-4 and CD8a cells in uninfected mice was 0．91%and 0．086%，indicating a gradual decline（P＜0．05）．ConclusionThis study suggests that SjFBPA may have a potential value for the Th2 response．DC cells as presenting cells are involved in the immune response．

Key wordsSchistosoma japonicum；SjFBPA；Th2 response

中圖分類號R 383．24

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1566-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81171606）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥230022

作者簡介：胡媛媛，女，碩士研究生；