王蓓華，朱亮亮，劉曉穎，范禮斌

RACK 1及其缺失突變體與CLIC1的共定位研究

王蓓華，朱亮亮，劉曉穎，范禮斌

摘要目的運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建活化蛋白激酶C受體1（RACK1）突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行RACK1突變體的表達(dá)、定位及其與胞內(nèi)氯離子通道蛋白1（CLIC1）蛋白的共定位研究，為其進(jìn)一步的功能研究奠定基礎(chǔ)。方法以RACK1全長(zhǎng)cDNA序列為模板，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1-RACK1-N（1-138）-FLAG、pcDNA3．1-RACK1-C（130-317）-FLAG；Western blot法檢測(cè)突變體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)；用免疫熒光技術(shù)了解突變體蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的共定位情況。結(jié)果成功構(gòu)建了RACK1突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒；Western blot法檢測(cè)到蛋白主要在胞質(zhì)中表達(dá)，核內(nèi)有部分表達(dá)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，RACK1及突變體蛋白主要定位在胞質(zhì)與核膜，細(xì)胞核中也有少量表達(dá)，與CLIC1蛋白存在共定位。結(jié)論成功構(gòu)建了RACK1缺失突變體，并在真核細(xì)胞中成功表達(dá)；RACK1及突變體與CLIC1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均存在不同程度的共定位，蛋白之間可能存在相互作用，為RACK1蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞RACK1；質(zhì)粒構(gòu)建；轉(zhuǎn)染；免疫熒光；Western blot

2015-06-15接收

劉曉穎，女，副教授，責(zé)任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn；

范禮斌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn

活化蛋白激酶C受體1（the receptor for activated C kinase 1，RACK1）基因，開放閱讀框有1 142 bp，分子量為36 ku，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，編碼含317個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)［1-2］。RACK1的整體結(jié)構(gòu)與G蛋白β亞基的色氨酸-天冬氨酸40（WD40）重復(fù)區(qū)域高度同源，也是WD40家族中的一員，最初發(fā)現(xiàn)［3-4］是由于其能結(jié)合并局部激活蛋白激酶C（PKC），不同的RACKs與不同的PKC同工酶相互作用，其中RACK1與βⅡPKC作用［5-6］。RACK1能與多種信號(hào)分子如胞外蛋白調(diào)節(jié)激酶（ERK）、應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）、β整合素、離子型谷氨酸受體（NMDA）等相互作用，參與調(diào)控細(xì)胞免疫應(yīng)答，細(xì)胞生長(zhǎng)分化，腫瘤發(fā)生、發(fā)展等［7］。該研究將構(gòu)建的突變體與野生型的表達(dá)及定位進(jìn)行比較，了解RACK1及其突變體與胞內(nèi)氯離子通道蛋白1（CLIC1）蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的共定位情況，為進(jìn)一步確定RACK1的具體功能區(qū)域奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細(xì)胞系COS7、HEK 293T、真核表達(dá)載體pcDNA3．1（＋）、感受態(tài)E．coli TG1細(xì)胞均為生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1．1．2主要試劑pfu DNA polymerase（上海生工生物工程有限公司）；T4 DNA連接酶，DMEM高糖培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾科技有限公司）；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅤ（加拿大Fermentas）；膠回收試劑盒（美國(guó)Axygen）；質(zhì)粒提取試劑盒（美國(guó)OMEGA）；胎牛血清（美國(guó) Hyclone）；LipofectamineTM2000、Opti-MEM（美國(guó) Invitrogen）；Nuclear Extract （NE）buffer、Cytoplasmic Extract（CE）buffer、FLAG M2單抗（美國(guó)Sigma）；TRITC／FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；熒光封片膠（丹麥DAKO公司）；PVDF膜（加拿大 BioBasic公司）；SuperSignal West Pico顯色試劑盒（美國(guó)Pierce公司）。

1．2方法

1．2．1缺失突變體序列擴(kuò)增突變體的構(gòu)建基于真核表達(dá)載體pcDNA3．1（＋），見圖1。根據(jù)目的基因序列和引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)特異性PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，以RACK1全長(zhǎng)cDNA序列為模板，以50μl PCR體系分別進(jìn)行擴(kuò)增，模板DNA10 ng，上下游引物各20 pmol，pfu DNA polymerase（5 U／μl）1μl。使用廠商推薦的PCR反應(yīng)程序，最終產(chǎn)物由1．2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠回收試劑盒回收。

1．2．2缺失突變體的構(gòu)建擴(kuò)增產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅤ進(jìn)行雙酶切，1．2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠回收試劑盒回收。酶切產(chǎn)物與相應(yīng)的酶切載體經(jīng)T4 DNA連接酶，于16℃連接過夜；連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TG1，均勻涂布于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)皿上，37℃倒置培養(yǎng)約12 h；挑取單克隆在含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩過夜；抽取質(zhì)粒后雙酶切鑒定，將陽性克隆的菌液送公司測(cè)序。

1．2．3Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)及定位HEK 293T細(xì)胞和COS7細(xì)胞在5% 胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LipofectamineTM2000與重組質(zhì)粒的比例為1∶1。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌1次，棄盡PBS，用5倍體積的CE buffer重懸細(xì)胞，冰浴并間隔震蕩5 min，3 000 r／min離心收集上清液，加等量2×SDS loading buffer，沸水浴5 min備用；余下沉淀用不含NP-40的CE buffer洗滌3次以除盡胞質(zhì)蛋白，加入與沉淀等體積的NE buffer，冰浴并間隔震蕩10 min，3 000 r／min離心收集上清液，加等量2×SDS loading buffer，沸水浴5 min，SDS-PAGE膠電泳分離；100 V，濕轉(zhuǎn)1 h；室溫下PVDF膜在5%脫脂奶粉封閉液中孵育2 h，F(xiàn)LAG單抗（1∶500）4℃孵育過夜，TBST充分漂洗；二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST充分漂洗；ECL顯色試劑盒顯影。

1．2．4熒光定位COS7細(xì)胞在5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1 d在35 mm皿中置蓋玻片接種一定數(shù)量的細(xì)胞，使得轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞匯合度達(dá)50%以上。分別轉(zhuǎn)染野生型RACK1表達(dá)質(zhì)粒及其缺失突變體，LipofectamineTM2000與重組質(zhì)粒的比例為1∶1；轉(zhuǎn)染6 h后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；24 h后固定細(xì)胞，F(xiàn)LAG M2單抗孵育2 h，TRITC／FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育1 h，DAPI染核后，熒光封片膠封片；4℃存儲(chǔ)過夜，激光共聚焦顯微鏡觀察定位情況。

2　結(jié)果

2.1RACK 1缺失突變體的構(gòu)建與鑒定擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和載體經(jīng)過雙酶切后產(chǎn)生相同的粘性末端，通過連接酶連接，形成重組質(zhì)粒，其中僅含有單個(gè)酶切位點(diǎn)，如果構(gòu)建成功，酶切鑒定時(shí)會(huì)在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶，見圖2。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)目的片段正確插入到pcDNA3．1（＋）載體中。

2.2RACK 1及其缺失突變體在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)，見圖3。A、B圖分別為野生型和突變體在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)結(jié)果，與目的蛋白分子量一 致，即RACK1-FLAG、RACK1-N-FLAG和RACK1-C-FLAG的分子量分別為36、16和21 ku。由于野生型RACK1和突變體RACK1-N在HEK 293T細(xì)胞中正常表達(dá)，突變體 RACK1-C在HEK 293T中表達(dá)過低（免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示在HEK 293T中也能夠表達(dá)，數(shù)據(jù)未顯示），所以這里用COS7細(xì)胞進(jìn)行RACK1-C的蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

2.3RACK1缺失突變體在COS7中的定位轉(zhuǎn)染24 h后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，見圖4A。野生型RACK1主要在胞質(zhì)中表達(dá)且存在斑塊狀分布，核膜處表達(dá)增多，細(xì)胞核中也有部分表達(dá)；缺失突變體pcDNA3．1-RACK1-N和pcDNA3．1-RACK1-C主要在胞質(zhì)中呈斑點(diǎn)狀分布，細(xì)胞核中也有少量表達(dá)，野生型與突變體蛋白在COS7細(xì)胞中的定位未發(fā)生明顯變化。RACK1及其缺失突變體質(zhì)粒分別與CLIC1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入COS7中，結(jié)果見圖4B。CLIC1在胞質(zhì)、胞核及核膜處均有明顯的表達(dá)，與RACK1及缺失突變體均有有共定位存在。

3　討論

本研究將RACK1突變體（N端和 C端）構(gòu)建于真核表達(dá)載體pcDNA3．1（＋），分別轉(zhuǎn)染至HEK 293T和COS7細(xì)胞中，初步了解其在真核細(xì)胞中的表達(dá)和定位。結(jié)果顯示，野生型RACK1主要分布在胞質(zhì)與核膜處，細(xì)胞核中有少量表達(dá)；缺失突變體pcDNA3．1-RACK1-N和pcDNA3．1-RACK1-C主要呈斑塊狀分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中表達(dá)較少，突變體和野生型的細(xì)胞定位未發(fā)生明顯變化；野生型RACK1及其兩個(gè)突變體與CLIC1蛋白均存在部分共定位，提示蛋白之間可能存在相互作用。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過其他實(shí)驗(yàn)證實(shí)野生型RACK1蛋白與CLIC1蛋白存在相互作用（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

接下來將RACK1及其兩個(gè)突變體構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-5X-3中，誘導(dǎo)GST融合蛋白表達(dá)，進(jìn)行GST-pulldown實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證RACK1突變體蛋白與CLIC1蛋白是否存在相互作用。

互作蛋白能夠特異性結(jié)合RACK1特定的WD區(qū)域，如PKCβ、Src、PDE4D5、干擾素受體等的結(jié)合區(qū)域都在WD5-7范圍［8］，該區(qū)域?qū)儆诠δ軈^(qū)域。本研究所構(gòu)建的突變體RACK1-N包含了WD1-3區(qū)域，突變體RACK1-C涵蓋了WD5-7區(qū)域，為后續(xù)RACK1的功能研究、確定與其互作蛋白結(jié)合的精細(xì)結(jié)構(gòu)等研究奠定了基礎(chǔ)。研究［9］表明RACK1參與離子通道的功能，pkd2L1能夠通過Ca2＋、Na＋、K＋，是一種非選擇性的陽離子通道，RACK1的WD6與WD7結(jié)構(gòu)域能夠與pkd2L1的Ala19-Pro45片段相互作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，RACK1可與GABAA受體（GABAAR）的胞漿區(qū)結(jié)合［10］，GABAAR是一種配體門控氯離子通道，所以對(duì)RACK1是否與胞內(nèi)氯離子通道蛋白相互作用具有一個(gè)很好的提示。本研究中的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)RACK1及其突變體蛋白與氯離子通道蛋白1（CLIC1）存在共定位，提示蛋白之間可能存在相互作用。RACK1蛋白表達(dá)廣泛，有100多種蛋白與RACK1相互作用，這些蛋白絕大多數(shù)已證實(shí)作為RACK1的結(jié)合伴侶，通過RACK1進(jìn)行功能調(diào)節(jié)［11-14］。關(guān)于RACK1和CLIC1結(jié)合的生理功能研究有待進(jìn)一步探索。

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The co-localization of RACK1 and itsmutants w ith CLIC1

Wang Beihua，Zhu Liangliang，Liu Xiaoying，et al
（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjective To construct the eukaryotic expression plasmids of the receptor for activated C kinase 1

（RACK1）mutants using molecular cloning techniques and observe the expression and cellular localization of RACK1 mutants and their co-localization with chloride intracellular channel protein 1（CLIC1）for further study on the cellular functions of RACK1 protein．MethodsRACK1 mutants were amplified by PCR with the template including the full length cDNA fragment of RACK1．Eukaryotic plasmids pcDNA3．1-RACK1-N（1-138）-FLAG，pcDNA3．1-RACK1-C（130-317）-FLAG were constructed respectively．The cellular expression and localization of RACK1 and itsmutants inmammalian cellswere detected byWestern blotand confocal fluorescencemicroscopy respectively．Resu ltsAll the plasmids of RACK1 mutantswere successfully constructed．Western blot and confocal fluorescencemicroscopy results indicated that RACK1 and itsmutants localized both in cytoplasm and nucleus，mainly in cytoplasm．The co-localization existed between RACK1 and CLIC1，and themutants of RACK1 had similar co-localization with CLIC1．ConclusionRecombinant plasmids of RACK1 mutants are constructed successfully and express effectively in eukaryotic cells．RACK1 protein and itsmutants appear to co-localizewith CLIC1 respectively，which implies that RACK1 and itsmutantsmay interact with CLIC1 respectively in mammalian cells．The study is very important for exploring the function of RACK1．

Key wordsRACK1；recombinant plasmids；transfection；fluorescence；Western blot

中圖分類號(hào)R 349．65；R 349．83

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1543-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（編號(hào)：81201368）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)系，合肥230032

作者簡(jiǎn)介：王蓓華，女，碩士研究生；