平春光，程海燕，高聞達(dá)，計(jì)永勝，劉　淼，任翠平，邵延靖，華夢(mèng)晴，沈際佳

IL-6RFP在小鼠血吸蟲(chóng)感染中對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用

平春光1，程海燕1，高聞達(dá)2，計(jì)永勝1，劉淼1，任翠平1，邵延靖1，華夢(mèng)晴1，沈際佳

摘要目的探討鼠白介素6受體融合蛋白（m IL-6RFP）在BALB／c小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型中對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。方法通過(guò)親和層析方法獲得可阻斷白介素-6（IL-6）的m IL-6RFP，經(jīng)人類肝癌細(xì)胞（HepG2）IL-6刺激及阻斷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)GG）和結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，HP）的mRNA表達(dá)變化，體外驗(yàn)證重組蛋白m IL-6RFP的生物活性。建立BALB／c小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型，于感染第24天起經(jīng)尾靜脈注射m IL-6RFP，隔天注射每次100μg／只，感染第42天剖殺小鼠。HE染色法檢測(cè)小鼠肝臟肉芽腫面積，熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠肝組織IL-1β、IL-13、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和趨化因子1（CXCL1）的mRNA表達(dá)，連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)小鼠肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）。結(jié)果HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示m IL-6RFP可降低IL-6對(duì)該細(xì)胞的刺激作用，顯著下調(diào)FGG和HP的表達(dá)（P ＜0．05）。在小鼠感染模型中阻斷IL-6后，肝功能指標(biāo)ALT和AST與溶劑對(duì)照組相比均顯著下降（P＜0．05），肉芽腫病變無(wú)顯著性差異。結(jié)論在BALB／c小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型中m IL-6RFP可明顯改善肝細(xì)胞功能，但對(duì)肉芽腫形成未見(jiàn)明顯作用。

關(guān)鍵詞IL-6；日本血吸蟲(chóng)；BALB／c小鼠

2015-05-20接收

2美國(guó)安泰吉生物技術(shù)與制藥有限公司，波士頓02118

沈際佳，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shenjijia ＠hotmail．com

血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲(chóng)病，目前我國(guó)仍是日本血吸蟲(chóng)病流行最嚴(yán)重的國(guó)家之一。血吸蟲(chóng)病主要致病機(jī)制是蟲(chóng)卵引起的肝臟肉芽腫和纖維化［1］。白細(xì)胞介素-13（interleukin-13，IL-13）在BALB／c小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型肝臟肉芽腫和纖維化的形成中發(fā)揮重要作用，感染鼠IL-13水平明顯升高，阻斷IL-13后纖維化可顯著改善［2-3］。細(xì)胞因子IL-17在C57BL／6小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型肝臟肉芽腫的形成中也發(fā)揮重要作用，感染鼠IL-17顯著升高，采用中和抗體阻斷IL-17，小鼠肝臟肉芽腫病變和肝功能損傷都顯著減輕［4］。有報(bào)道［5］指出在大鼠敗血癥模型中IL-6顯著升高，阻斷IL-6可顯著降低肝細(xì)胞損傷。此外，IL-6在免疫性疾病中可介導(dǎo)免疫損傷［6］。前期研究［4］顯示IL-6在小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型中顯著升高，但I(xiàn)L-6在血吸蟲(chóng)病發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。該研究旨在探討鼠白介素6受體融合蛋白（mouse interleukin-6 receptor fusion protein，m IL-6RFP）在BALB／c小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型中對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1主要試劑低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；重組人白介素-6（recombinant human interleukin-6，rhIL-6）購(gòu)自上海普欣生物技術(shù)有限公司；SYBR Premix Ex Taq II定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、總蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（連續(xù)監(jiān)測(cè)法）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）檢測(cè)試劑盒（連續(xù)監(jiān)測(cè)法）購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；重組蛋白m IL-6RFP由安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室純化獲得；質(zhì)粒pcDNA3．1攜帶鼠IL-6受體融合蛋白基因序列（m IL-6RFP-pcDNA3．1）由美國(guó)波士頓Antagen生物制藥研究所高聞達(dá)教授惠贈(zèng)；本研究所用其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．1．2細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人類肝癌細(xì)胞（HepG2）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；SPF級(jí)BALB／c小鼠，6～8周齡，雌性，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；日本血吸蟲(chóng)感染陽(yáng)性釘螺購(gòu)自江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1m IL-6RFP活性驗(yàn)證取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，接種于6孔板中，細(xì)胞癌度為2．5×105／m l，2 m l／孔，完全低糖DMEM（含10%FBS、100 IU／m l雙抗），37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24 h。HepG2細(xì)胞饑餓處理，將完全低糖DMEM更換成不含血清的低糖DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h［7］，再將培養(yǎng)基更換成完全低糖DMEM。參照文獻(xiàn)［8］設(shè)置如下實(shí)驗(yàn)，正常對(duì)照組不做任何特殊處理；IL-6刺激組添加rhIL-6，使其終濃度為100 ng／ml；IL-6阻斷組，rhIL-6和m IL-6RFP以分子數(shù)之比為1∶40混合、37℃孵育30 min后將混合物添加到相應(yīng)培養(yǎng)孔；溶劑對(duì)照組添加與IL-6阻斷組等體積的蛋白溶劑。各組添加相應(yīng)試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集各孔細(xì)胞。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．2HepG2細(xì)胞總 RNA提取和RT-PCR6孔板中各組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2次，每孔加TRIzol試劑1 ml，反復(fù)吹打后轉(zhuǎn)移到1．5 m l EP管，提取總RNA。采用Nano Drop儀器檢測(cè)RNA濃度后，根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq II定量PCR試劑盒的操作步驟配制RT-PCR反應(yīng)體系20μl，設(shè)置反應(yīng)條件，采用GAPDH作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法對(duì)RT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，判斷各組細(xì)胞纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)GG）和結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，HP）的mRNA表達(dá)差異。本次及后續(xù)定量PCR實(shí)驗(yàn)所需引物見(jiàn)表1。

表1　引物序列

1．2．3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及IL-6阻斷18只BALB／c小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組。將感染了日本血吸蟲(chóng)的陽(yáng)性釘螺置于25～28℃溫水中，用白熾燈照射至尾蚴逸出，IL-6阻斷組和溶劑對(duì)照組每鼠經(jīng)腹部皮膚感染尾蚴（20±2）條。IL-6阻斷組小鼠感染第24天開(kāi)始經(jīng)尾靜脈注射m IL-6RFP、每隔1 d注射、每次100μg／只，直至第40天注射最后1次，第42天剖殺。溶劑對(duì)照組注射等體積的蛋白溶劑，方法同IL-6阻斷組。正常對(duì)照組不做任何特殊處理。

1．2．4標(biāo)本采集小鼠于感染第42天剖殺、采集所需標(biāo)本。小鼠全血采集后于37℃溫箱靜置1 h，3 000 r／min離心10 min，分離血清，-80℃保存。采集肝臟標(biāo)本，采集肝左葉用10%福爾馬林固定；從相同部位采集2塊肝臟，每塊約0．1 g，分別用于RT-PCR檢測(cè)和蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)。

1．2．5小鼠肝臟蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)將肝臟置于青霉素瓶，每0．1 g肝臟加1 ml 5%KOH溶液，充分剪碎，37℃溫箱消化3 h，期間每0．5 h晃動(dòng)1次以促進(jìn)消化。消化結(jié)束后充分混勻，每次吸取20μl涂片，普通光學(xué)顯微鏡下（×40）計(jì)蟲(chóng)卵數(shù)，每鼠計(jì)數(shù)3次，取平均數(shù)。

1．2．6小鼠肝臟肉芽腫病變檢測(cè)取10%福爾馬林固定的肝組織，石蠟包埋，切片厚度4μm，每鼠切3個(gè)部位，每部位1張切片。經(jīng)HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下（×40）拍照，采用 Image Tool 3．0軟件分別圈出每張切片的肉芽腫面積和總面積，分別計(jì)算IL-6阻斷組和溶劑對(duì)照組中每只小鼠肉芽腫面積所占比例。

1．2．7小鼠血清ALT和AST檢測(cè)采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)血清 ALT和 AST的活性。試劑1和試劑2按照4∶1的比例混勻即為工作液，將50μl血清加入1 ml工作液中混勻，分別檢測(cè)樣本混勻后1、2、3 min時(shí)的吸光度值（absorbance，A）A1、A2和A3，波長(zhǎng)340 nm。計(jì)算平均變化吸光度（ΔA／min）。濃度換算按如下公式：ALT（IU／L）＝ΔA／min×3 376。AST檢測(cè)和換算方法與ALT相同。

1．2．8小鼠肝臟組織總RNA提取和RT-PCR將肝臟組織從RNAlater溶液中取出，放入TRIzol溶液中，充分剪碎后電動(dòng)勻漿器勻漿，提取總RNA。采用Nano Drop儀器檢測(cè)RNA濃度后，根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqⅡ定量PCR試劑盒的操作步驟配制RT-PCR反應(yīng)體系20μl，設(shè)置反應(yīng)條件，采用β-actin作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法對(duì)RTPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，判斷各組肝組織中IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1的mRNA表達(dá)差異。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 17．0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。

2　結(jié)果

2.1m IL-6RFP的體外生物活性驗(yàn)證FGG和HP 的mRNA表達(dá)水平在正常對(duì)照組、IL-6刺激組、IL-6阻斷組和溶劑對(duì)照組中的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F ＝40．593、111．687，P＜0．05）。兩兩比較顯示，F(xiàn)GG 和HP的mRNA表達(dá)水平在正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-6阻斷組中FGG和HP的mRNA表達(dá)水平均低于IL-6刺激組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。說(shuō)明m IL-6RFP具有阻斷IL-6的生物活性。見(jiàn)圖1。

2．2肝臟蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)各組小鼠于血吸蟲(chóng)尾蚴感染第42天剖殺，小鼠肝臟蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)結(jié)果顯示溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組蟲(chóng)卵密度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組感染程度一致，后續(xù)實(shí)驗(yàn)具有可比性，見(jiàn)圖2。

2．3肝臟肉芽腫病變檢測(cè)小鼠肝臟切片經(jīng)HE染色，溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組均能觀察到明顯的肉芽腫病變，說(shuō)明造模成功，見(jiàn)圖3B、3C。小鼠肝臟切片經(jīng)HE染色后采用Image Tool 3．0軟件處理，分別計(jì)算溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組中每只小鼠肉芽腫面積所占比例，溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組肉芽腫面積比例無(wú)差異，見(jiàn)圖3D。

2.4肝功能指標(biāo)ALT和AST檢測(cè)ALT和AST的活性在正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組中的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝48．600、41．476，P＜0．05）。正常對(duì)照組小鼠肝功能指標(biāo)ALT均值為26 IU／L，AST均值為30 IU／L，兩者都在正常范圍（＜40 IU／L）。溶劑對(duì)照組小鼠肝功能指標(biāo)ALT均值為306 IU／L，AST均值為348 IU／L；IL-6阻斷組小鼠在阻斷IL-6后肝功能指標(biāo)ALT均值為135 IU／L，AST均值為175 IU／L。兩兩比較中，ALT和AST的活性在IL-6阻斷組中均低于溶劑對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。說(shuō)明IL-6阻斷組中m IL-6RFP蛋白對(duì)血吸蟲(chóng)感染小鼠肝功能指標(biāo)ALT和AST活性均起到明顯的降低作用。見(jiàn)圖4。

2.5細(xì)胞因子和趨化因子mRNA水平檢測(cè)IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1的mRNA水平表達(dá)在正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組中的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝20．365、9．020、20．514、31．654，P ＜0．05）。兩兩比較中，IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1的mRNA表達(dá)水平在溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組中均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；而溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

3　討論

IL-6信號(hào)活化存在經(jīng)典途徑和間接途徑兩種方式。經(jīng)典途徑即IL-6先與膜結(jié)合型受體IL-6R結(jié)合，而后與gp130二聚體作用將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)；間接途徑即IL-6先與可溶型受體sIL-6R結(jié)合，再與細(xì)胞膜上的gp130二聚體作用將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)［9］。間接途徑使IL-6的靶細(xì)胞不再局限于細(xì)胞膜上同時(shí)表達(dá)IL-6R和gp130二聚體的細(xì)胞，而是所有細(xì)胞膜上表達(dá)gp130二聚體的細(xì)胞都成為其潛在靶細(xì)胞［10］。IL-6具多種生物學(xué)功能，可誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白表達(dá)、T細(xì)胞激活和B細(xì)胞的分化，因此在炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用［11］。此外，IL-6參與多條促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成等的信號(hào)通路［12］。因此阻斷IL-6信號(hào)通路成為治療相關(guān)疾病的重要策略，IL-6R的單克隆抗體塔西抗體已作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、卡斯特萊曼病和全身型關(guān)節(jié)炎的藥物應(yīng)用于臨床，并有可能通過(guò)進(jìn)一步研究用于治療更多其它的自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾?。?3］。本研究所用的重組蛋白m IL-6RFP基因序列長(zhǎng)度為2 088 bp、分子量為94 ku，由gp130配體結(jié)合域、IL-6R配體結(jié)合域和HisTag標(biāo)簽三部分組成［14］。重組蛋白m IL-6RFP是一種IL-6拮抗劑，在其IL-6R配體結(jié)合域能和gp130配體結(jié)合域共同作用下可阻斷IL-6與受體的結(jié)合，從而抑制IL-6的生物效應(yīng)［8］。

本次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用HepG2細(xì)胞表達(dá)IL-6R，用IL-6刺激后FGG和HP的mRNA水平呈現(xiàn)高表達(dá)［7］，實(shí)驗(yàn)中m IL-6RFP通過(guò)與IL-6R競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-6，抑制IL-6生物效應(yīng)，表明獲得的m IL-6RFP是一種有生物學(xué)活性的蛋白，為進(jìn)一步研究IL-6在相關(guān)疾病模型中的作用提供了有用的材料。雖然IL-6 在C57BL／6小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型中表達(dá)顯著升高，但I(xiàn)L-6在此模型中所起的作用尚不清楚［4］。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示m IL-6RFP不能使IL-6阻斷組小鼠肝臟肉芽腫病變發(fā)生明顯改變，由此推測(cè)其它因素在起作用。在IL-6阻斷組小鼠肝臟中IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1的mRNA水平均顯著升高，這與這些炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子在肉芽腫形成和發(fā)展中起重要作用的報(bào)道［3-4］相符。該結(jié)果部分解釋了IL-6在BALB／c小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型肝臟肉芽腫形成中不起主要作用，IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1在本動(dòng)物模型中是更強(qiáng)的致炎因素。而IL-17在C57BL／6小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型肉芽腫形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，采用IL-17中和抗體阻斷IL-17后肝臟肉芽腫病變顯著減輕［4］，并且IL-6在Th17細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮一定的作用［12］。但該研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BALB／c小鼠的IL-17 mRNA水平在溶劑對(duì)照組和IL-6阻斷組中表達(dá)量均未升高，與C57BL／6小鼠日本血吸蟲(chóng)感染模型結(jié)果不同，這可能與兩種品系小鼠免疫系統(tǒng)反應(yīng)差異有關(guān)。

研究［5］報(bào)道在大鼠敗血癥模型中，肝細(xì)胞受到損傷后ALT和AST顯著增高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-6的mRNA水平和蛋白水平也明顯增高，采用抑制劑（EX527）可阻斷IL-6的生物效應(yīng)，即抑制了IL-6對(duì)肝功能指標(biāo)ALT和AST活性的影響。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示ALT和AST在IL-6阻斷組比溶劑對(duì)照組顯著下降，因?yàn)閙 IL-6RFP在小鼠體內(nèi)能結(jié)合IL-6并阻斷其生物效應(yīng)，從而抑制IL-6對(duì)肝細(xì)胞酶活性的影響，顯示了其可改善肝功能指標(biāo)的作用。

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IL-6RFP can protect liver function in themodel ofm ice infected w ith Schistosoma japonicum

Ping Chunguang1，Cheng Haiyan1，Gao Wenda2，etal
（1Dept of Microbiology and Parasitology，Anhui Medical University，Hefei230032；2Antagen Pharmaceuticals，Inc．，Boston02118）

AbstractObjectiveTo explore the role ofmouse interleukin-6 receptor fusion protein（m IL-6RFP）for the protection of liver cells in themodel of BALB／cmice infected with Schistosoma japonicum．MethodsNickel ion column was used to obtain purified recombinantm IL-6RFP protein．In vitro，HepG2 cellswere used to verify the biological activity ofm IL-6RFP．BALB／c mice were administrated by tail vein injection with 100μg ofm IL-6RFP or equal volume solvent，at24，26，28，30，32，34，36，38，and 40 days after infection．Mice were sacrificed 48 h after the last injection．The granuloma size wasmeasured in themouse liver by HE staining．Interleukin-1β（IL-1β），interleukin-13（IL-13），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and chemokine（C-X-C motif）ligand 1 （CXCL1）mRNA levels in mouse liver tissue were detected by RT-PCR．Alanine aminotransferase（ALT）and aspartate transaminase（AST）were measured by the continuousmonitoring method．Resu ltsHepG2 cells experiments showed thatm IL-6RFP could reduce the effectof IL-6 on HepG2 cells，fibrinogen（FGG）and haptoglobin （HP）was significantly reduced（P＜0．05）．In the BALB／c mice infected with Schistosoma japonicum，when IL-6 wasblocked the levelsof ALT and AST were decreased significantly（P＜0．05）compared with thatof the solvent group，while there was no significant difference on granuloma formation．ConclusionIn the BALB／c mice infected with Schistosoma japonicum，m IL-6RFP can significantly improve the liver function but no obvious effect on granuloma formation．

Key wordsIL-6；Schistosoma japonicum；BALB／c mice

中圖分類號(hào)R 383．24；R 392．3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1538-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30972569、81471982）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，合肥230032

作者簡(jiǎn)介：平春光，男，碩士研究生；