趙楚生，王奕忠，吳令杰，郭旭武

（廣東省汕頭市中心醫(yī)院，廣東汕頭515031）

·臨床論著·

Micro RNA-146a基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者抗病毒療效的相關(guān)性

趙楚生，王奕忠，吳令杰，郭旭武

（廣東省汕頭市中心醫(yī)院，廣東汕頭515031）

目的探討micro RNA-146a（miR-146a）基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）和慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者干擾素-α（IFN-α）治療應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)性。方法選擇接受IFN-α抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者133例，其中應(yīng)答組79例，無(wú)應(yīng)答組54例。采集兩組靜脈血并提取DNA，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對(duì)miR-146a行SNP分型。結(jié)果miR-146a CT基因型與TT基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）；CC基因型與TT基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029）。T等位基因與C等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020）。結(jié)論MiR-146a基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者抗病毒療效相關(guān)，T等位基因或TT基因型與IFN治療應(yīng)答相關(guān)，而C等位基因或CC基因型與干擾素治療應(yīng)答無(wú)相關(guān)。

RNA；基因多態(tài)性；肝炎病毒；等位基因

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種導(dǎo)致急、慢性乙型肝炎的病原體，世界上約有4億慢性HBV感染者，其中75％為亞洲人。急性感染可導(dǎo)致嚴(yán)重致命的爆發(fā)性肝炎，慢性感染可導(dǎo)致肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，所以在許多國(guó)家，這是一非常嚴(yán)重的問(wèn)題[1]。干擾素-α（Interferon-α，IFN-α）有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗增生及基因誘導(dǎo)特性。應(yīng)用IFN-α治療可使CHB患者獲得病毒學(xué)應(yīng)答，并可改善臨床結(jié)果[2]。影響IFN-α療效的因素很多，本研究目的是探討microRNA-146a（miR-146a）基因多態(tài)性對(duì)慢性乙型肝炎患者IFN-α抗病毒治療應(yīng)答的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選取2010年1月-2013年12月本院感染科就診的CHB患者133例，HBeAg陽(yáng)性及HBV-DNA陽(yáng)性，所有患者接受24～72周的普通IFN或聚乙二醇化干擾素（PEG-IFN）治療。根據(jù)患者對(duì)IFN-α的病毒學(xué)反應(yīng)分成應(yīng)答組（n=79）和非應(yīng)答組（n=54）例。應(yīng)答組定義為治療期間患者血清HBV-DNA＜100 IU/ml，隨訪1年未復(fù)發(fā)。非應(yīng)答組定義為治療期間未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，或者達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)后隨訪1年復(fù)發(fā)。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集和基因組DNA提取抽取靜脈血1 ml，乙二胺四乙酸抗凝外周全血。將1 ml全血加至2.5 ml抽提緩沖液中，60℃保溫1 h，15 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中。加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻抽提至水乳膠融狀。15 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中。加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，置入-20℃冰箱保溫30～60min，緩慢混勻DNA成絮狀析出。15 000 r/min離心10 min，棄上清液。用70％乙醇洗2次沉淀DNA，加入400μl TE buffer溶解DNA。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP）分析利用PCR-RFLP方法分析miR-146a基因多態(tài)性。其中PCR引物參照J(rèn)AZDZEWSKI等[3]的報(bào)道，并行PubMed blast比對(duì)，與擴(kuò)增產(chǎn)物符合。PCR反應(yīng)體系為20μl，包括300 ng的基因組DNA，正、反向引物各0.2μmoL/L，10×PCR buffer 2μl，2.5 mmol/L dNTPs 2μl及l(fā)μl Taq DNA聚合酶（日本TaKaRa公司）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，共33個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min，于40℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖溴化乙錠電泳分析，100 bp DNA Marker（日本TaKaRa公司）作為參照組，驗(yàn)證目的片段是否擴(kuò)增成功。138 bp PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MspⅠ（立陶宛MBI Fermentas公司）消化，37℃、5 uEcoRⅠ過(guò)夜反應(yīng)，經(jīng)3％瓊脂糖溴化乙錠凝膠電泳分析。單一138 bp條帶代表野生型TT純合子，雙帶112和26 bp代表突變的CC純合子，3條帶138、112和26 bp代表CT雜合子。為確保基因型分析的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取10％PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與酶切結(jié)果100％符合。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)，兩組患者等位基因頻率行Hardy-Weinberg equilibrium分析、等位基因頻率比較及A值計(jì)算用χ2檢驗(yàn)，以TT基因型作為參照，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者一般資料比較

兩組患者年齡、性別、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.130、0.627、0.420和0.685）。兩組患者感染HBV的途徑比較，包括輸血史、吸毒史、其他醫(yī)療操作或其他方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.281），具有可比性。

2.2MiR-146a基因多態(tài)性分析

MiR-146a序列和PCR產(chǎn)物序列測(cè)序結(jié)果見圖1。MiR-146a PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為138 bp。其中野生型TT純合子不能被EcoRⅠ酶切，仍為138 bp。突變的CC純合子可被EcoRⅠ完全酶切，產(chǎn)物片段為112和26 bp（因片段太小，電泳條帶不清楚）。CT雜合子的擴(kuò)增產(chǎn)物部分酶切，可見138、112和26 bp片段（因片段太小，電泳條帶不清楚）。見圖2。

2.3MiR-146a C/T基因多態(tài)性與患者抗病毒療效的相關(guān)性

圖1 測(cè)序結(jié)果

慢性乙型肝炎患者miR-146a基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.610，P=0.382），說(shuō)明研究對(duì)象具有群體代表性。兩組患者中miR-146a CT雜合子為主要的基因型，CT基因型與TT基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[A=2.935，（95％CI：1.291，6.341），P=0.009]，CC基因型與TT基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A=3.027，95％CI：1.048，9.078，P=0.029）。應(yīng)答組的T等位基因頻率（64.6％）比非應(yīng)答組（49.1％）高，而非應(yīng)答組的C等位基因頻率（50.9％）比應(yīng)答組（35.4％）高，且C等位基因與T等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=1.782，95％CI：1.028和2.914，P=0.020）。miR-146a CC基因型或C等位基因可能與慢性乙型肝炎患者抗病毒療效欠佳有關(guān)。見附表。

圖2 miR-146a C/T多態(tài)性位點(diǎn)EcoRⅠ酶切電泳圖

附表 兩組患者的miR-146a C/T基因多態(tài)性例（％）

3 討論

IFN-α是目前治療乙型肝炎病毒感染具有持久療效的抗病毒藥物，有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，可以清除HBV，抑制肝臟壞死性炎癥，降低肝硬化或肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)性。據(jù)報(bào)道，應(yīng)用IFN-α治療的患者中，HBeAg陽(yáng)轉(zhuǎn)率約為40％，HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率約為50％[4]。

與核苷類似物相比，IFN-α治療療程有限，治療應(yīng)答率偏低。尋找影響治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因素對(duì)制定個(gè)體化治療方案、節(jié)省醫(yī)療成本、避免副反應(yīng)，具有一定的臨床意義。研究證實(shí)，高丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平（＞200 u/L）、女性、低HBV載量、病毒基因型（B＞C）等因素可預(yù)測(cè)HBcAg陽(yáng)性的慢性HBV患者對(duì)干擾素治療的應(yīng)答，并預(yù)示良好的應(yīng)答效果[5-6]。除上述影響療效的外在因素，不同個(gè)體的遺傳背景亦影響自身對(duì)藥物的反應(yīng)性。通過(guò)SNP的研究，可以從遺傳背景的角度探討影響療效的預(yù)測(cè)因素，并為闡明干擾素確切的作用機(jī)制提供線索。

MiRNA是一種在機(jī)體中高度保守的20～23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼RNA，能夠廣泛地參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，包括調(diào)節(jié)生物體的生物學(xué)和各種疾病的進(jìn)程[7]。其中miR-l46a作為較早發(fā)現(xiàn)的與免疫炎癥相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，與乙肝肝癌的易感性密切相關(guān)[8]。

本研究表明，miR-146a CT雜合子在慢性乙型肝炎患者中占優(yōu)勢(shì)，且CT基因型與野生TT基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CT基因型在非應(yīng)答組頻率較高，表明CT基因型比野生TT基因型療效差。C等位基因與T等位基因比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明C等位基因或CC基因型與患者對(duì)干擾素應(yīng)答欠佳或治療后復(fù)發(fā)率高相關(guān)。MiR-146a基因多態(tài)性可能影響相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而影響疾病對(duì)藥物的療效。下一步筆者將通過(guò)研究miR-146a的可能調(diào)控因素和相關(guān)基因表達(dá)，為慢性乙型肝炎患者個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

[1]金仙玉,張新宇.乙型肝炎病毒母嬰傳播及其預(yù)防的研究現(xiàn)狀[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志,2013(7)∶258-260.

[2]江曉燕,陳明勝,劉寧.不同HBV基因型慢性乙型肝炎干擾素治療的臨床療效[J].福建醫(yī)藥雜志,2013,35(6)∶78-80.

[3]JAZDZEWSKI K,MURRAY EL,FRANSSILA K,et al.Common SNP in pre-miR-146a decreases mature mir expression and predisposes to papillary thyroid carcinoma[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(20)∶7269-7274.

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[5]徐學(xué)俊.干擾素治療慢性乙型肝炎的長(zhǎng)期療效觀察[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2006,13(5)∶758-760.

[6]葉志典,陳勇毅,羅賢鑫,等.慢性乙型肝炎不同炎癥分級(jí)與干擾素抗病毒療效探討[J].現(xiàn)代醫(yī)院,2013,13(4)∶10-12.

[7]MORISHITA A,MASAKI T.MiRNA in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology Research,2014,45(2)∶128-141.

[8]侯召華.MiR146a參與HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制的分子機(jī)制研究[D].濟(jì)南∶山東大學(xué),2012.

（申海菊 編輯）

MicroRNA-146a gene polymorphism and antiviral therapy of chronic hepatitis B

Chu-sheng ZHAO,Yi-zhong WANG，Ling-jie WU,Xu-wu GUO
(Shantou Central Hospital,Shantou,Guangdong 515031,P.R.China)

【objertive】To investigate the relationship between the single nucleotide polymorphism(SNP)on miR-l46a gene and the treatment effects of TFN-α.【Methods】Totally 133 patients of chronic hepatitis B infection who

the treatment of IFN-α were enrolled in this study.The patients were divided into two groups:sustained virological response(n=79)group and non virological response(NVR)or recurrence(n=54)group.Blood samples were collected and chromosomal DNA was extracted.The miR-146a polymorphism was determined with the method of polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCRRFLP).【Results】In our study,there was a statistical association between miR-146a polymorphism and the antiviral therapy efficacy in the hepatitis B patients.There was a statistical difference in the CT genotype and the TT genotype of miR-146a between the two groups(P=0.009).There was a significant difference in the CC genotype and TT genotype between the two groups(P=0.029).There was a significant difference in the C allele and T allele between the two groups(P=0.02).【Conclusions】These findings suggested that the SNP in miR-146a is associated with the antiviral therapy efficacy of hepatitis B patients.And the TT genotype or T alleles is associated with the response to TFN-α therapy while the CC genotype or C allele is not related to the response to TFN-α therapy or recurrence.

RNA;gene;hepacivirus;allele

R512.62

A

1005-8982（2015）35-0070-03

2014-03-27