王曉寧,張艷虹,徐鳳芹

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著////研究·

化濁通脈方對動脈粥樣硬化兔主動脈小凹蛋白1及親環(huán)素A的影響

王曉寧1,張艷虹1,徐鳳芹2

目的研究化濁通脈方對動脈粥樣硬化(AS)兔膽固醇跨膜逆轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白小凹蛋白-1(cav-1)及親環(huán)素A(Cyclophilin A)的影響,探討其通過促進(jìn)膽固醇跨膜逆轉(zhuǎn)運(yùn)抗AS的可能機(jī)制。方法40只新西蘭兔隨機(jī)分為空白對照組、模型組、中藥復(fù)方組、辛伐他汀組。采用單純高脂喂養(yǎng)法復(fù)制兔AS模型。造模、給藥15周后取胸主動脈,HE染色觀察各組動脈斑塊形成,蛋白印跡法(WB)測定主動脈壁內(nèi)cav-1及親環(huán)素A表達(dá)量,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)測定主動脈壁內(nèi)cav-1及親環(huán)素AmRNA表達(dá)量,觀察實(shí)驗(yàn)藥物對膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示,模型組兔胸主動脈管壁上粥樣斑塊形成明顯,各給藥組較模型組有不同程度的改善。WB結(jié)果顯示,與對照組相比模型組cav-1表達(dá)量明顯下降(P< 0.01),與模型組相比,辛伐他汀組cav-1表達(dá)增加(P<0.05),中藥復(fù)方組cav-1表達(dá)量也有增加趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對照組相比,模型組親環(huán)素A表達(dá)明顯增多(P<0.05),與模型組相比,中藥復(fù)方組及辛伐他汀組親環(huán)素A蛋白表達(dá)減少(P<0.01)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,與對照組相比模型組cav-1 mRNA表達(dá)量明顯減少(P<0.01),與模型組相比,辛伐他汀組及中藥復(fù)方組cav-1mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.01);模型組較對照組親環(huán)素AmRNA表達(dá)量減少,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,辛伐他汀組及中藥復(fù)方組較模型組相比親環(huán)素A mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。結(jié)論化濁通脈方能夠通過適度調(diào)節(jié)cav-1及親環(huán)素A的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,減少斑塊中親環(huán)素A的過度表達(dá),減少AS血管壁內(nèi)泡沫細(xì)胞及斑塊的形成,最終達(dá)到抗AS的作用。

動脈粥樣硬化;化濁通脈方;小凹蛋白-1;親環(huán)素A

動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病機(jī)制尚不能明確。高膽固醇血癥是AS的一項(xiàng)重要危險(xiǎn)因素,膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)可使膽固醇從脂肪細(xì)胞中流出,轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟代謝,最后經(jīng)膽汁或其他途徑排出體外[1]。小凹蛋白-1(Caveo lin-1,cav-1)及親環(huán)素A是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出至胞膜的重要蛋白[2,3]。本研究通過高脂飲食構(gòu)建實(shí)驗(yàn)兔AS模型,觀察化濁通脈方對AS兔胸主動脈管壁cav-1、親環(huán)素A蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響,探討其抗AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 純種健康新西蘭大耳白兔40只,雄性,(8~10)周齡,體重2.275 kg±0.155 kg,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供,單籠飼養(yǎng),9 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及特殊飼料 化濁通脈方顆粒劑由北京康仁堂藥業(yè)公司生產(chǎn),由澤瀉、虎杖、草決明、郁金等共七味中藥組成;辛伐他汀片(商品名:舒降之),20 mg/片,杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn);高脂飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 電泳儀(Tanon,VE-

180),轉(zhuǎn)膜儀(Tanon,VE-186),定量PCR儀(StepOne PLUS App lied Biosystems),凝膠成像系統(tǒng)(JY04S-3C,北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

1.4 模型制備與分組給藥方法 參照文獻(xiàn)配比高脂飼料[4],采用單純高脂喂養(yǎng)法建立兔AS模型。新西蘭兔40只,按隨機(jī)數(shù)表法分為4組,每組10只?？瞻讓φ战M予普通飼料150 g/d;模型組予高脂飼料150 g/d。各組每日給藥量:中藥復(fù)方組由澤瀉、虎杖、決明子、郁金等共七味中藥組成,合計(jì)生藥6.5 g/(kg·d);辛伐他汀組合辛伐他汀1 mg/(kg·d)。連續(xù)喂養(yǎng)15周。

1.5 觀察項(xiàng)目及檢測方法 WB檢測cav-1/親環(huán)素A蛋白表達(dá),采用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影,結(jié)果以X光片顯示。掃描儀收集圖像,并使用Quan tity One分析目標(biāo)條帶及內(nèi)參蛋白β-actin灰度值,做初步定量統(tǒng)計(jì)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)測定cav-1 mRNA/親環(huán)素AmRNA表達(dá),PDH為內(nèi)參對照,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。根據(jù)擴(kuò)增曲線,設(shè)置空白對照組表達(dá)量為1,采用2ΔΔCt計(jì)算各組cav-1 mRNA及親環(huán)素A mRNA相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,有差異者采用LSD法進(jìn)一步組間兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔AS主動脈病理比較 空白對照組內(nèi)膜光滑,內(nèi)皮細(xì)胞層連續(xù)完整,平滑肌細(xì)胞排列整齊緊密有序,內(nèi)皮下未見脂質(zhì)沉積;模型組內(nèi)皮層脫落,內(nèi)膜明顯增厚,管壁內(nèi)滿布斑塊,可見大量泡沫細(xì)胞,中外膜不規(guī)則增厚,可見泡沫細(xì)胞浸潤;中藥復(fù)方組及辛伐他汀組內(nèi)膜均稍有增厚,管壁內(nèi)皮細(xì)胞較連續(xù),內(nèi)膜下可見少量散在泡沫細(xì)胞沉積,未見明顯斑塊,中外膜與對照組厚度無明顯差異,較模型組薄。

2.2 各組動脈管壁組織cav-1及親環(huán)素A蛋白表達(dá)水平(見表1) 空白對照組動脈管壁組織豐富表達(dá)cav-1蛋白,模型組cav-1表達(dá)量明顯下降(P<0.01),中藥復(fù)方組cav-1表達(dá)量也有所下降(P<0.05);與模型組相比,辛伐他汀組cav-1表達(dá)增加(P<0.05),中藥復(fù)方組與模型組相比cav-1表達(dá)也有增加趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 各組動脈管壁cav-1 mRNA及親環(huán)素A mRNA表達(dá)水平比較(見表1) 根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果繪制基因擴(kuò)增曲線及熔解曲線,擴(kuò)增曲線光滑,熔解曲線呈明顯單峰,各曲線峰值基本一致,說明產(chǎn)物單一,擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高。根據(jù)Ct值,以對照組為1,使用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組基因的相對表達(dá)量。

表1 各組動脈管壁cav-1及親環(huán)素A蛋白及mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表1 各組動脈管壁cav-1及親環(huán)素A蛋白及mRNA表達(dá)水平比較(±s)

組別小凹蛋白1親環(huán)素A蛋白表達(dá)量空白對照組1.275±0.3204)1.000±0.2674)1.013±0.1273)1.000±0.蛋白水平mRNA表達(dá)量蛋白水平mRNA 251模型組0.692±0.2522)0.480±0.1852)1.284±0.1571)0.969±0.226辛伐他汀組1.010±0.2013)0.861±0.3054)0.793±0.1061)3)1.596±0.4752)4)中藥復(fù)方組0.910±0.181 1.010±0.4352)0.799±0.2772)1.779±0.5462)4)與空白對照組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<0.01。

3 討 論

化濁通脈方由澤瀉、虎杖、草決明、郁金等共七味中藥組成,是中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院徐鳳芹教授結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn),以濁、痰、瘀、毒為AS的病機(jī)基礎(chǔ),總結(jié)出的防治AS中藥復(fù)方。方中以澤瀉利濕祛濁為君藥;虎杖清濕熱、散瘀毒,草決明潤腸通便從而使?jié)嵝坝蟹掷雎返葹槌妓?郁金行氣通脈等為佐使之藥。是以化濁祛濕通絡(luò)為綱,佐以行氣、清化脂濁之藥,七藥并用,共奏化濁祛濕,散瘀通脈之功。對于AS患者降斑、穩(wěn)斑及降脂方面均有較為良好的療效。前期基礎(chǔ)試驗(yàn)研究亦表明,化濁通脈方可顯著降低AS兔膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白等指標(biāo)。但目前,化濁通脈方抗AS的作用機(jī)制尚未明確,近年來,RCT成為抗AS研究的熱點(diǎn),通過cav-1在內(nèi)的多種蛋白參與,使細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流,機(jī)體排出過多膽固醇[5]。

小凹(caveo lae)是細(xì)胞膜表面的一種特異性的內(nèi)陷微區(qū),是信號傳導(dǎo)中心,與其他相關(guān)受體與蛋白協(xié)同膽固醇的跨膜逆轉(zhuǎn)運(yùn),亦是細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的主要部位[6]。小凹蛋白(Caveo lin)是構(gòu)成小凹的標(biāo)志性核心蛋白[7],cav-1是Caveolin的家族成員,其在正常細(xì)胞中豐富表達(dá),并參與許多重要的細(xì)胞活動,包括信號傳導(dǎo)、小泡運(yùn)輸、調(diào)控膽固醇的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制腫瘤等,對維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的動態(tài)平衡有著重要影響[8]。但同時(shí),cav-1也是炎癥反應(yīng)中心[9],過度表達(dá)的cav-1能促進(jìn)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)皮增生,反而加重AS[10]。親環(huán)素A是一種胞質(zhì)蛋白,屬于親免素家族,為胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體系主要復(fù)合物成分之一,cav-1與親環(huán)素A復(fù)合體作為轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的主要運(yùn)載工具,參與膽固醇的正常轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。然而近年來大部分研究證實(shí)親環(huán)素A可促進(jìn)炎癥反應(yīng),誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷致血管炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致諸多心血管疾病,如AS、主動脈夾層、心臟肥大等[12-14]。

本研究通過病理形態(tài)學(xué)證明化濁通脈方能夠抗AS形成。模型組兔主動脈cav-1蛋白及mRNA表達(dá)量明顯下降;辛伐他汀組與模型組相比,cav-1蛋白及mRNA表達(dá)量明顯增加;中藥復(fù)方組與模型組相比,cav-1mRNA表達(dá)明顯增多,應(yīng)促進(jìn)cav-1蛋白生成,而cav-1蛋白水平雖高于模型組但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮可能原因?yàn)閏av-1蛋白運(yùn)載胞內(nèi)膽固醇至胞外而使蛋白消耗。模型組兔親環(huán)素A蛋白水平明顯升高,中藥復(fù)方組及辛伐他汀組蛋白水平明顯減少,表明降濁通脈方及辛伐他汀可能通過抑制親環(huán)素A在斑塊內(nèi)過度表達(dá)以減少炎癥反應(yīng)。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組親環(huán)素A的mRNA水平與蛋白表達(dá)水平卻成相反趨勢,考慮其原因可能為模型組形成的斑塊及炎癥反應(yīng)促進(jìn)了親環(huán)素A的蛋白質(zhì)合成,使其表達(dá)增加,但尚未對基因水平有所影響;降濁通脈方和辛伐他汀促進(jìn)親環(huán)素A基因表達(dá),使其合成更多蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn),使該兩組親環(huán)素A蛋白正常消耗而無過度表達(dá)。

本研究結(jié)果表明,降濁通脈方能夠通過提高cav-1及親環(huán)素A的基因水平,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,保障cav-1蛋白的正常表達(dá),減少斑塊中親環(huán)素A的過度表達(dá),最終達(dá)到抗AS的作用。

[1] 廖端芳,覃麗.小凹及小凹蛋白1:膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)與炎癥應(yīng)答的共同分子平臺[J].中國動脈硬化雜志,2012,20(5):385-392.

[2] Le Lay S,Hajduch E,Lindsay MR,eta l.Cholestero l induced caveo lintarge ting to lipid drop lets in ad ipocytes:A role for caveolar endocytosis[J].Tra ffic,2006,7(5):549-561.

[3] Hayashi K,Ma tsuda S,Machida K.Invasion activating caveolin-1 mutation in human scirrhous breast cancers[J].Cancer Res, 2001,61(6):2361-2364.

[4] 符凌,常小榮.免疫損傷-高脂喂養(yǎng)法建立兔動脈粥樣硬化模型的方法與體會[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2010,8:853-854.

[5] Ma rina C,Rader DJ.Macrophage reversecholesterol transpo rtkey to the regression of a the rosclerosis[J].Circu lation,2006, 113:2548-2555.

[6] 武明花,蘇琦.小凹-小凹蛋白的生物學(xué)特性[J].國外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊,2003,24(6):337-338.

[7] Sowa G.Caveo lae,Caveolins,Cavins,and endothelial cell function:New Insigh ts[J].Front Physiol,2012,2:120.

[8] 何清,王長謙.小凹蛋白1在動脈粥樣硬化中的作用[J].中國動脈硬化雜志,2006,14(6):547-549.

[9] 廖端芳,覃麗,唐朝克.小凹及小凹蛋白1介導(dǎo)炎癥應(yīng)答與膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)之間的相互作用[J].中國動脈硬化雜志,2011,19 (3):233.

[10] 戴先鵬,熊國祚.Caveolin-1在炎癥反應(yīng)中的作用[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(9):29-31.

[11] 涂光輝,王北冰,嚴(yán)鵬科,等.親環(huán)素A在巨噬細(xì)胞荷脂過程中的表達(dá)及普羅布考干預(yù)的影響[J].中國動脈粥樣硬化雜志,2006, 14(4):293-296.

[12] 董曉蕾,李蓉,蔡輝.親環(huán)素A在心血管疾病中作用的研究進(jìn)展[J].嶺南心血管病雜志,2012,18(4):444-447.

[13] Taguchi I,Abe S,Inoue T.Cyc lophilin A is a promising predictor of coronary artery disease[J].Circ J,2013,77:321-322.

[14] Satoh K,Nigro P,Zeidan A,eta l.Cyclophilin A promotes card-i ac hypertrophy in apolipopro tein E-de ficien tmice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(5):1116-1123.

Effects of Huazhuo Tongmai Decoction on Caveolin C1 and Cyclophilin A in Rabbit’s Aortas Atherosc lerosis

Wang Xiaoning,Zhang Yanhong,Xu Fengqin
Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

Xu Fengqin(Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medica l Sciences,Beijing 100091,China)

ObjectiveTo study the effect of Huazhuotongmaicompound on the key reverse transcription protein caveolin-1(Cav-1) and cyclophilin A of rabbits with atherosc lerosis(AS)and to investigate the possible mechanismof Huazhuo Tongmai decoction (HTD)in preventing AS through promoting reverse cholesterol transport(RCT).MethodsForty New Zealand rabbits were randomly divided into control group,model group,compound group and simvastatin group.The rabbits with AS were remodeled by feeding with simple hyper cholester old iet.The thoracic aortas were stripped for observation of artery plaque formation by HE staining after 15 weeks of drugs delivery.The Cav-1 and cyclophilin A in aortas was tested by Western blotting(WB)and the expression of Cav-1 and cyclophilin A mRNA in aortas was tested by Rea l-time PCR,which were designed to observe the effects of experiment drugs on proteins related to RCT proteins.ResultsThe results of HE staining show that there was markedly formation of atheromatous plaque on the wa llof thoracic aorta,while itwas improved in different degrees in medicated groups.The results of WB show that the Cav-1 in model group was significantly lower(P<0.01)compared with control group,the Cav-1 in simvastatin group was higher (P<0.05)compared with modelgroup,while there was no significant differences between compound groups and modelgroup(P> 0.05).The expression of cyclophilin A in the model group was significantly higher than that in controlgroup(P<0.05),and those in compound groups and simvastatin group were lower than that in mode l group(P<0.01).The same results of the expression of Cav-1 mRNA by Real-time PCR was alsofound,but there was no statistically significance in the exp ression of cyclophilin A mRNA in model group,which was lower than that in contro l group.The exp ression in compound group and simvastatin group were higher than those in model groups.ConclusionThe HTD can regulate the expression of Cav-1 and cyclophilin A,promote the outflow of cholesterol in cell,reduce excessive expression of cyclophilin A and formation of foamcells and atherosclerotic plaque,finally reach the anti-atherosclerotic effect.

Huazhuo Tongmaidecoction;atherosclerosis;caveolin-1;cyclophilin A

R543 R256

:A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.07.007

1672-1349(2015)07-0884-03

2015-01-18)

(本文編輯王雅潔)

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)(北京100029);2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院(北京100091)

徐鳳芹,E-mail:doctorxu@a liyun.com;xiaoning861126@126.com