張鶴

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司

蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

張鶴

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司

心腦血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，溶栓劑的研究與開發(fā)具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。溶栓劑來源廣泛，其中微生物來源的溶栓劑展現(xiàn)出誘人的前景。本實驗通過對20種大型真菌進(jìn)行篩查，研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草深層培養(yǎng)發(fā)酵液中具有纖溶活性物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)蛹蟲草纖溶酶中有兩個活性組分，本實驗對蛹蟲草纖溶酶第三活性組分相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。由SDS-PAGE測定蛹蟲草纖溶酶由單個亞基組成相對分子量約為28000Da；蛹蟲草纖溶酶具有直接纖溶活性，對纖溶酶原的激活作用不明顯。

蛹蟲草；纖溶酶；酶學(xué)性質(zhì)

1.實驗材料

蛹蟲草纖溶酶（經(jīng)純化后獲得的第三組分）、透析袋、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、β-巰基乙醇、瓊脂糖、考馬斯亮蘭R-250、溴酚蘭、凝血酶、牛血纖維蛋白原、α-萘酚、胃蛋白酶。

2.實驗方法

2.1.SDS-PAGE法測定蛹蟲草纖溶酶相對分子質(zhì)量

①樣品處理方法：精提純后的酶液經(jīng)透析除鹽，再將其濃度濃縮至2mg/mL，取15μl樣品，加入等體積變性樣品溶解液，電泳前煮沸3～5min。

②選擇凝膠濃度為12%（w/v）的分離膠，5%（w/v）的濃縮膠，交聯(lián)度為2.6%，灌注于雙垂直板電泳模具中。

③電泳方法：上樣后，先恒電壓80V，待樣品進(jìn)入分離膠后恒電壓120V，當(dāng)含有溴酚藍(lán)指示劑的前沿到達(dá)凝膠底部時結(jié)束電泳，大約要3～4h。

④固定、染色和脫色：電泳完畢后，小心取出凝膠，在15%(w/v)三氯乙酸固定液中固定過夜，再用考馬斯亮蘭R250染色液染色4h，然后用脫色液脫色，直至背景清晰無色。最后用凝膠成像系統(tǒng)分析測定目標(biāo)蛋白的相對分子量。

2.2.蟲草纖溶酶對纖溶酶原的激活作用

市售的纖維蛋白原大都混有纖溶酶原，如果將配制好的血纖維平板在85℃下保溫30min，則可以使纖溶酶原失活，經(jīng)過這樣處理的平板稱為陰性平板，在此平板上形成溶圈顯示的是纖溶酶的直接纖溶活性，不經(jīng)過此處理的平板稱為陽性平板。通過對比陰陽性平板上透明溶圈的大小可以檢驗纖溶酶是否具有激活纖溶酶原的活性。測定時，分別點同一酶樣10μL于陽性和陰性平板上，平行點五次，然后比較蛹蟲草纖溶酶在陽性和陰性平板上的活性差異，若兩者相差較大，即表明此蛹蟲草纖溶酶有激酶活性，若兩者差異較小，即此蛹蟲草纖溶酶的纖溶酶原激酶活性不明顯。

2.3.蟲草纖溶酶對人血纖維蛋白原的降解情況

將2%人血纖維蛋白原23μL與23μL 0.01mg/mL的酶液混勻置于離心管中于37℃分別保溫30S、1min、5min、10min、2h、4h、6h、 8h、12h，定時快速取出加入10μL等體積樣品溶解液，沸水浴終止酶促反應(yīng)。將保溫不同時間的反應(yīng)液進(jìn)行SDS-PAGE垂直板電泳，電泳時加入還原的人血纖維蛋原作對照，通過觀察α、β和γ鏈的含量變化確定該纖溶酶對人血纖維蛋白原各亞基的降解情況。

3.實驗結(jié)果

3.1.SDS-PAGE法測定蛹蟲草纖溶酶相對分子質(zhì)量

本實驗選擇交聯(lián)度為2.6%，凝膠濃度為12%，選用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量范圍是14,400～97,400Da。

用SDS-PAGE測定經(jīng)分離純化后的蛹蟲草纖溶酶純酶樣品的相對分子質(zhì)量。經(jīng)電泳檢測并應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)的Labworks軟件分析出該亞基相對分子質(zhì)量約為28000Da。

3.2.蟲草纖溶酶對纖溶酶原的激活作用

用加熱血纖維蛋白平板法測定蛹蟲草纖溶酶對人纖溶酶原是否有激活作用，比較陽性和陰性平板上的活性差異，若陽性平板的溶圈明顯比陰性平板的大，即表明此蛹蟲草纖溶酶有纖溶酶原激酶活性，若兩者無明顯差異，即此蛹蟲草纖溶酶的纖溶酶原激酶活性不明顯。

通過對平板的觀察，蛹蟲草纖溶酶在陰性平板上的溶圈直徑比陽性平板的溶圈直徑小，因此可以判斷此蛹蟲草纖溶酶不但可以直接降解血纖維蛋白，而且具有激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶共同參與溶栓的作用。

3.3.蟲草纖溶酶對人血纖維蛋白原的降解情況

本實驗用SDS-PAGE檢測蛹蟲草纖溶酶對人血纖維蛋白原的降解規(guī)律，分離膠濃度選擇12%，降解圖譜如圖2-9，30S后α鏈就開始降解，1min后α鏈和β鏈都完全降解，2h后γ鏈降解完畢，這一降解順序與人纖溶酶降解纖維蛋白原各亞基的情況是一樣的。

4.結(jié)論

本文以蛹蟲草為菌種液體發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶，對純化后的纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)做了研究。得出以下結(jié)論：①蛹蟲草纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)此蛹蟲草纖溶酶的相對分子質(zhì)量約為28000Da。②Aprotinine和SBTI對此蛹蟲草纖溶酶的活性有明顯抑制作用，由此可以判斷出這種新型纖溶酶可能是絲氨酸蛋白酶。③該酶可以順次降解人血纖維蛋白的α、β和γ三個亞基。該酶不但可以直接降解血纖維蛋白，而且具有激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶共同參與溶栓的作用。

[1]祁輝，余蓉，李曉紅等.一株誘變枯草桿菌溶栓酶性質(zhì)研究的初探.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,2003，19(1)：5-7

[2]吳冠蕓，潘華珍，吳翠.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗常用數(shù)據(jù)手冊（第一版）.科學(xué)出版社，1999

[3]李建武，蕭能賡，余瑞元，等.生物化學(xué)實驗原理和方法（第一版）.北京：北京大學(xué)出版社，2002，168～170