晏 容，劉 云，朱欣婷，易小飛，劉 流，李曉飛

（1.遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貴州 遵義563003；2.遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心，貴州遵義563003；3.貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，遵義563003）

不同斑蝥素類物質對人肝癌細胞HepG2增殖作用的研究

晏 容1，3，劉 云2，3，朱欣婷1，3，易小飛1，劉 流1，李曉飛1，3

（1.遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貴州 遵義563003；2.遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心，貴州遵義563003；3.貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，遵義563003）

目的 觀察斑蝥素酸鎂、斑蝥素及斑蝥素酸鈉3種斑蝥素類物質對人肝癌細胞HepG2的體外抗腫瘤活性。方法 （1）采用磺酰羅丹明染色法（SRB法）檢測不同濃度斑蝥素酸鎂、斑蝥素及斑蝥素酸鈉在體外對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用；（2）使用透射電鏡觀察2.27 μmol/L斑蝥素酸鎂作用于肝癌細胞HepG248 h后細胞超顯微結構的變化。結果 （1）斑蝥素酸鎂、斑蝥素及斑蝥素酸鈉對人肝癌細胞HepG2有明顯抑制作用，抑制率隨藥物濃度的增加而升高，且呈劑量效應關系，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為2.27、5.70、8.41 μmol/L；（2）透射電鏡下見核染色質聚集成塊附著于核膜下，且見核異形等凋亡細胞形態(tài)特征。結論 斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2的抑制作用優(yōu)于斑蝥素和斑蝥素酸鈉，且斑蝥素酸鎂可以誘導人肝癌細胞HepG2發(fā)生凋亡。

斑蝥素/類似物和衍生物； 比色法； 肝腫瘤； 免疫組織化學； 染色與標記； 細胞凋亡； 腫瘤細胞，培養(yǎng)的

中藥昆蟲芫菁體內(nèi)的斑蝥素被認為是抗癌的主要有效物質，其可治療原發(fā)性肝癌、喉癌、食管癌、宮頸癌等[1]。一直以來人們認為斑蝥素在斑蝥體內(nèi)的存在形式只有一種游離態(tài)，但本研究發(fā)現(xiàn)，在斑蝥體內(nèi)存在游離斑蝥素和結合斑蝥素2種形式[2]，并且常用中藥斑蝥（大斑芫菁和眼斑芫菁）體內(nèi)的結合斑蝥素多數(shù)為斑蝥素的鹽類衍生物[3]，根據(jù)用藥的臨床經(jīng)驗推測，這些鹽類衍生物具有更好的抗腫瘤作用。為了證實這一推測，本研究以提取眼斑芫菁體內(nèi)的斑蝥素為原料，自主合成了斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈉2種鹽類衍生物，并對其體外抗腫瘤活性進行研究，以期獲取更好的具有較大價值的抗癌藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物來源 斑蝥素由產(chǎn)自貴陽的眼斑芫菁提取并純化[4]（純度大于或等于98%）；斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈉由自制斑蝥素合成而來[5]。

1.1.2 肝癌細胞株 人肝癌細胞HepG2購于中國科學院細胞庫。

1.1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），南美胎牛血清、胰蛋白酶（美國HYCLONE公司），磺酰羅丹明（SRB，美國Sigma公司）等。

1.1.4 主要儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan spectrum全波長酶標儀（美國Thermo公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；JEM-1400型透射電鏡（日本電子株式會社）等。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌細胞HepG2的培養(yǎng) 采用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至培養(yǎng)瓶底部面積達80%左右，棄去培養(yǎng)液，給予磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 SRB染色法 將細胞懸液平行接種于4塊96孔板中（細胞濃度為8×104mL-1，每孔100 μL），其中1塊為對照板，另3塊為實驗板，培養(yǎng)20 h后，采用50%三氯乙酸（TCA）固定對照板（T0），4℃保存待測。實驗板中以加入不同濃度藥物（斑蝥素酸鎂、斑蝥素、斑蝥素酸鈉）組為實驗組（T），同時設空白對照組（C）及溶劑對照組。每組有5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出培養(yǎng)板，依照參考文獻[6]方法進行SRB染色。最后在酶標儀上選擇530 nm波長測吸光度值（OD值），按照公式計算生長抑制率，腫瘤生長抑制率

1.2.3 不同濃度斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2形態(tài)的影響 將不同濃度的斑蝥素酸鎂分別作用于人肝癌細胞HepG2，48 h后將其置于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況及形態(tài)變化。

1.2.4 透射電鏡觀察斑蝥素酸鎂作用后人肝癌細胞HepG2超微結構的變化 于培養(yǎng)瓶中接種2×106mL-1的細胞懸液（每瓶4 mL），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。20 h后棄上清液，再加入配置好的斑蝥素酸鎂，藥物終濃度為半數(shù)抑制濃度（IC50），空白對照組加等量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后收集細胞，依照參考文獻[7]方法進行細胞樣品處理，最后上機觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用 1.25 μmol/L斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，其抑制作用更加明顯。以藥物濃度為橫坐標、抑制率為縱坐標作回歸曲線，得方程Y=74.703 ln（X）-11.571（R2=0.972 1）。最終計算得到IC50為2.27 μmol/L。見表1。

2.2 斑蝥素對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用3.31 μmol/L斑蝥素對人肝癌細胞HepG2有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，其抑制作用更加明顯。以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作回歸曲線，得方程Y= 71.560 ln（X）-74.595（R2=0.965 3）。最終計算得到IC50為5.70 μmol/L。見表2。

表1 斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2增殖的影響（n=5）

表2 斑蝥素對人肝癌細胞HepG2增殖的影響（n=5）

2.3 斑蝥素酸鈉對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用 5.25 μmol/L的斑蝥素酸鈉對人肝癌細胞HepG2的生長有明顯抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用更加明顯。以藥物濃度為橫坐標、抑制率為縱坐標作回歸曲線，得方程Y=64.892 ln（X）-88.328（R2=0.987 0）。計算得到IC50為8.41 μmol/L。見表3。

表3 斑蝥素酸鈉對人肝癌細胞HepG2增殖的影響（n=5）

2.4 不同濃度斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2形態(tài)的影響 與空白對照組比較，當斑蝥素酸鎂濃度為1.25 μmol/L時，細胞數(shù)目略減少；當斑蝥素酸鎂濃度為1.88、2.50 μmol/L時，細胞數(shù)量明顯減少，細胞貼壁差；當斑蝥素酸鎂濃度為3.13、3.75 μmol/L時，僅剩余少數(shù)細胞，并且出現(xiàn)細胞皺縮，體積變小、變圓的現(xiàn)象。見圖1。

圖1 不同濃度斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2形態(tài)的影響（100×）

2.5 透射電鏡觀察斑蝥素酸鎂作用后人肝癌細胞HepG2超微結構的變化 空白對照組肝癌細胞表面有突起，核質比正常，核膜核仁清晰，線粒體、內(nèi)質網(wǎng)清晰可見（圖2A）。2.27 μmol/L斑蝥素酸鎂作用于肝癌細胞后，細胞表面突起消失、核異形、核染色質聚集成塊附著于核膜下（圖2B）。

圖2 斑蝥素酸鎂作用后人肝癌細胞HepG2超微結構的變化

3 討 論

本實驗采用SRB法進行體外抗肝癌活性篩選，該法已成為美國國立癌癥研究所篩選抗癌藥物的一種新方法[8]。SRB法是利用蛋白質染色原理，避開了某些腫瘤細胞還原酶活力低下，難以采用噻唑藍（MTT）比色法這一難題，與MTT法比較，SRB法具有操作時間短、結果穩(wěn)定、可靠、靈敏等優(yōu)點[9]，現(xiàn)已成為新一代抗腫瘤藥敏試驗及其他腫瘤藥理學研究的主要實驗手段之一。本實驗結果顯示，斑蝥素酸鎂、斑蝥素、斑蝥素酸鈉對肝癌細胞HepG2均有抑制作用，其中抑制作用最好的是斑蝥素酸鎂，其次是斑蝥素、斑蝥素酸鈉。斑蝥素是臨床常用藥物，具有較好的抗癌效果，但其不溶于水的化學性質制約了其作為注射液的應用，為此，已有研究制備出水溶性好的斑蝥素酸鈉用于臨床治療，并且已有斑蝥素酸鈉能有效抑制人肝癌細胞增殖的文獻報道[10-11]。本實驗證實，斑蝥素酸鎂對肝癌細胞的體外抗癌活性好于斑蝥素和斑蝥素酸鈉，并且斑蝥素酸鎂具有一定的水溶性，可以開發(fā)成針劑，解決了口服帶來的不良反應大、藥物吸收少的問題，具有很好的開發(fā)潛能。同時，本實驗采用透射電鏡觀察斑蝥素酸鎂作用于肝癌細胞HepG2后超微結構的變化，鏡下見移植瘤細胞表面突起消失、核異形、核染色質聚集成塊附著于核膜下等凋亡細胞形態(tài)變化，提示斑蝥素酸鎂可以誘導肝癌細胞HepG2發(fā)生凋亡。下一步實驗將選擇更多的人肝癌細胞，進一步考察斑蝥素酸鎂對肝癌的抑制作用及其機制，為其研發(fā)提供實驗依據(jù)。

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Effect of different cantharidin materials on proliferation of human hepatocellular carcinoma cells HepG2

Yan Rong1，3，LiuYun2，3，ZhuXinting1，3，YiXiaofei1，LiuLiu1，LiXiaofei1，3
（1.BasicMedicineSchool，ZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou563003，China；2.Medical and Biological Research Center，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；3.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines，Zunyi，Guizhou 563003，China）

Objective To investigate the in vitro anti-tumor activity of three kinds of cantharidin materials magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2.Methods （1）The sulforhodamine B（SRB）assay was employed to evaluate the inhibitory effect of magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2 in vitro；（2）the transmission electron microscopy was used to observe the ultra-structural changes after 2.27 μmol/L magnesium cantharidate acting on hepatocellular carcinoma cells HepG2for 48 h.Results （1）Magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate had obvious inhibitory effects on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells HepG2，the inhibitory rate was increased with the medication concentration increase，showing the dose-effect relationship，the half inhibitory concentrations（IC50）were 2.27，5.70，8.41 μmol/L，respectively；（2）the transmission electron microscopy found the morphological features of apoptotic cells，such as the nuclear chromatin was gathered into a block attaching to below the nuclear membrane，heteromorphic nucleus and so on.Conclusion The inhibiting effect of magnesium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2is superior to that of cantharidin and sodium cantharidate，moreover magnesium cantharidate can induce the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells HepG2.

Cantharidin/analogs&derivatives； Colorimetry； Liver neoplasms； Immunohistochemistry； Staining and labeling； Apoptosis； Tumor cells，cultured

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.001

A

1009-5519（2015）21-3209-03

2015-07-20）

國家自然科學基金（81560669）；貴州省科技廳社會發(fā)展攻關項目（黔科合SY字[2012]3082）；貴州省科技廳社會發(fā)展攻關項目（黔科合SY字[2011]3031）；貴州省教育廳特色重點實驗室建設項目（黔教合KY字[2014]212）；遵義市匯川區(qū)科技計劃項目（E-114）。

晏容（1978-），女，貴州遵義人，碩士研究生，副教授，主要從事昆蟲資源開發(fā)與利用的研究；E-mail：yanr3725881994@sina.com。

李曉飛（E-mail：lixiaofei35@gmail.com）。