包納日斯 何套格蘇 牧 丹 包青蘭

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)計(jì)算機(jī)信息學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)2013 級(jí)碩士研究生，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010;4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)2015 級(jí)碩士生，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010;)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種長期過量飲酒使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國NAFLD 的發(fā)病率可高達(dá)15%以上，并且隨著生活水平的提高，發(fā)病率正成倍增加［1］，因此，有效防治NAFLD，以及加強(qiáng)對(duì)NAFLD 治療的探討具有積極意義。本研究通過建立大鼠NAFLD 動(dòng)物模型，根據(jù)祖國傳統(tǒng)蒙醫(yī)藥理論“三根調(diào)節(jié)法”，即抑“赫依”、清“希拉”、祛“巴達(dá)干”［2］，使用蒙醫(yī)臨床中常用的、并取得了確切療效的蒙藥方劑巴日巴德-10，觀察其對(duì)NAFLD 大鼠肝功、血脂水平以及抗氧化能力的影響，為探索其作用機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物：馬來酸羅格列酮片，葛蘭素史克(天津)有限公司，批號(hào)：08030115;巴日巴德-10 -由國家蒙藥制劑中心(內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)院制劑室)提供【呼衛(wèi)注字(97)001-116】，批號(hào)：20120421。

1.2 動(dòng)物：SD 大鼠，SPF 級(jí)，體重80 -100g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2008 -24。

1.3 試劑：膽固醇，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：090521;膽鹽，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20090807;大鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，批號(hào)：200911;其余試劑盒均購自南京建成生物工程公司。

1.4 儀器：VARIOSKAN FLASH 2.4.3 全波長多功能讀數(shù)儀(Thermo);全自動(dòng)生化分析儀(7080)CDSYJYK022;AnkeTDL-60c 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);電子天平BP121s 型(STRTORIUS)。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物分組 SD 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1wk 后，按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組和模型對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組動(dòng)物給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料，模型對(duì)照組每天灌胃給予酒精(56%)加高脂乳劑(1000g 高脂飼料：100g 豬油，20g 膽固醇，5g 膽鹽，50g 蔗糖，825g 水)。于第4wk 末處死4 只大鼠，做血脂水平檢測及病理檢查，結(jié)果提示NAFLD 模型成功。將NAFLD 大鼠按體重隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽性藥物對(duì)照組(馬來酸羅格列酮片)、巴日巴德-10 大、中劑量組4 組，每組8 只動(dòng)物?？瞻讓?duì)照組給予等體積的蒸餾水，模型對(duì)照組組繼續(xù)灌服脂肪乳劑2wk 之后也給予等體積的蒸餾水，其余各組均按上述相應(yīng)給藥劑量給予相應(yīng)藥物，每天1 次，連續(xù)4wk。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)水和進(jìn)食(各組動(dòng)物均以大鼠標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng))。末次給藥后大鼠禁食16h，取血并分離血清檢測各項(xiàng)指標(biāo)。迅速取出肝臟，經(jīng)大體解剖觀察后，取肝組織約1g 左右，用冷的生理鹽水制成10%的肝組織勻漿，離心后取上清液，供肝組織勻漿指標(biāo)檢測。

1.5.2 血清指標(biāo)檢測 全自動(dòng)生化分析儀測定血清TG 、甘油三酯(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、LDL-C、AST、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、FFA 以及空腹血糖(FBS)，elisa 試劑盒測FINS 并計(jì)算空腹胰島素抵抗指數(shù)FIRI 評(píng)價(jià)其胰島素抵抗程度。FIRI = ln［FBS(mmol·L-1)× FINS(mU·L-1)/22.5］，F(xiàn)IRI 的大小與IR 程度呈正相關(guān)［4］。

1.5.3 肝組織勻漿指標(biāo)檢測 取肝組織勻漿上清液，全自動(dòng)生化儀測定TC、TG 含量。考馬斯亮藍(lán)法測定肝組織蛋白含量，按試劑盒說明測定超氧化物岐化酶(SOD)、MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)NNAFLD 模型大鼠血脂的影響：與空白對(duì)照組相比較NNAFLD 模型組大鼠TG、FFA 顯著升高(P＜0.01 或P＜0.05)。連續(xù)給藥4wk 后羅格列酮可顯著降低血清LDL-C 水平(＜0.05)，但對(duì)其他指標(biāo)無顯著影響。巴日巴德-10 可顯著降低血清TG、LDL -C、FFA 水平(P＜0.01 或P＜0.05)，但對(duì)TC、HDL-C 無顯著影響，見表1。

組別 劑量/g·kg -1 TG/mmol·L -1 TC/mmol·L -1 HDL-C/mmol·L -1 LDL-C/mmol·L -1 FFA/μmol·L -1.8 ±197.3模型對(duì)照組 0.58 ±0.15* 1.47 ±0.22 0.93 ±0.17 0.36 ±0.11 1518.7 ±412.4＊＊羅格列酮組 0.003 0.48 ±0.07 1.28 ±0.27 1.06 ±0.21 0.24 ±0.09# 1244.8 ±484.0*巴日巴德-10 2.500 0.36 ±0.06* ## 1.42 ±0.29 1.10 ±0.21 0.24 ±0.10# 926.8 ±247.6##巴日巴德-10 1.250 0.39 ±0.07## 1.26 ±0.19* 0.94 ±0.14* 0.20 ±0.04* ## 1240.0 ±269.7*空白對(duì)照組 0.45 ±0.05 1.40 ±0.26 1.11 ±0.14 0.30 ±0.10 868

2.2 對(duì)NNAFLD 模型大鼠肝功能指標(biāo)的影響：與空白對(duì)照組相比較NNAFLD 模型組大鼠AST 顯著升高(P＜0.01)。連續(xù)給藥4wk 后羅格列酮可顯著降低血清AST 水平(P＜0.05)，但對(duì)ALT 無顯著影響。蒙藥巴日巴德-10 可顯著降低AST 水平(P＜0.01)，對(duì)ALT 也無顯著影響，見表-2。

組別 劑量/g·kg -1 AST/IU·L -1 ALT/IU·L -1 149.1 ±27.0 46.80 ±11.95模型對(duì)照組 191.0 ±21.6＊＊ 48.45 ±10.16羅格列酮組 0.003 164.2 ±28.3# 46.25 ±6.78巴日巴德-10 2.500 152.1 ±26.3## 48.10 ±11.83巴日巴德空白對(duì)照組-10 1.250 155.3 ±20.2## 46.75 ±9.38

2.3 對(duì)NAFLD 模型大鼠FBS、FINS 以及FIRI 的影響 與空白對(duì)照組相比較NAFLD 模型組大鼠FINS、FIRI 顯著升高(P＜0.01 或P＜0.05)。連續(xù)給藥4wk 后羅格列酮可顯著降低FBS、FINS、FIRI 水平(P＜0.01 或P＜0.05)。巴日巴德-10 可顯著降低FINS、FIRI 水平(P＜0.01 或P＜0.05)，但對(duì)FBS 無顯著影響，見表3。

組別 劑量/g·kg -1 FBS/mmol·L -1 FINS/mU·L -1 FIRI 5.72 ±0.46 7.07 ±0.63 0.6 ±0.07模型對(duì)照組 5.79 ±0.66 10.64 ±1.40＊＊0.81 ±0.13*羅格列酮組 0.003 4.82 ±0.69* # 7.24 ±1.37## 0.42 ±0.24#巴日巴德-10 2.500 5.67 ±0.74 6.54 ±0.51## 0.52 ±0.19##巴日巴德空白對(duì)照組-10 1.250 5.75 ±0.20 6.61 ±0.41## 0.66 ±0.11

2.4 對(duì)NAFLD 大鼠肝組織中TG、TC、SOD 和MDA 的影響：與空白對(duì)照組相比較NAFLD 模型組大鼠肝組織TG、TC、MDA 水平顯著升高(P＜0.01)。給藥4wk 后羅格列酮可顯著降低TC，升高SOD 水平(P＜0.01 或P＜0.05)，但對(duì)TG、MDA 無顯著影響。蒙藥巴日巴德-10 可顯著降低TG、TC、MDA 水平(P＜0.01 或P＜0.05)，但對(duì)SOD 無顯著影響，見表4。

組別 劑量/g·kg -1 TG/mmol·L -1 TC/mmol·L -1 SOD/U·mg prot -1 MDA/nmol·mg prot -1 1.08 ±0.39 0.84 ±0.29 24.31 ±2.44 3.53 ±0.71模型對(duì)照組 1.76 ±0.51＊＊ 1.34 ±0.48＊＊ 22.88 ±0.52 5.26 ±0.93＊＊陽性對(duì)照組 0.003 1.58 ±0.45* 0.86 ±0.27## 24.42 ±1.33# 4.44 ±0.78*巴日巴德-10 2.500 0.98 ±0.24## 0.73 ±0.15## 25.11 ±2.86 3.31 ±0.95##巴日巴德-10 1.250 1.42 ±0.33 0.8 ±0.26## 23.98 ±1.52 3.空白對(duì)照組13 ±0.6##

3 討論

目前對(duì)NAFLD 的發(fā)病機(jī)理沒有完全解釋清楚，但它的病理生理學(xué)被認(rèn)為與酒精無關(guān)，與肥胖、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙、細(xì)胞因子和脂肪因子的相互作用、細(xì)胞凋亡以及小腸細(xì)菌的過度生長等有關(guān)［5］?，F(xiàn)在普遍認(rèn)同的是“二次打擊”學(xué)說，這個(gè)假說認(rèn)為“一次打擊”胰島素抵抗導(dǎo)致了肝臟脂肪變性，進(jìn)而出現(xiàn)脂肪代謝紊亂，TG、TC、FFA 等的堆積以及肝臟損傷?！岸未驌簟笔且匝趸瘧?yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)為中心。由氧化應(yīng)激引發(fā)的活性氧簇(ROS)的大量增加導(dǎo)致了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、炎癥、肝細(xì)胞凋亡和纖維化［6］。

蒙醫(yī)藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)重要組成部分，由于蒙古族主要以肉食品、乳制品、面食品等為主食的飲食習(xí)慣NAFLD的發(fā)病率較高，蒙醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作中有“脂肪過盛病”之說，即脂肪肝病。蒙醫(yī)理論認(rèn)為“脂肪過剩病”主要是由于調(diào)節(jié)人體生理平衡的“赫依”“希拉”“巴達(dá)干”(稱之為“三根”)功能失調(diào)，導(dǎo)致飲食未消化，肝臟內(nèi)脂肪聚集的一種消化系統(tǒng)慢性疾病。臨床中常采用“三根調(diào)節(jié)法”，抑“赫依”、清“希拉”、祛“巴達(dá)干”，使三根趨于平衡，從而維持人體生理的正常代謝［7-9］。代表方劑巴日巴德-10 在臨床中用于“三根調(diào)節(jié)”已經(jīng)獲得了確切療效，尤其對(duì)“混合型脂肪肝”的治療臨床上被公認(rèn)。

本實(shí)驗(yàn)通過灌胃給予高脂肪乳劑建立大鼠NAFLD 模型，造模后大鼠血清AST、FFA、TG、FIRI 顯著升高，TC、ALT、LDL-C 水平有升高的趨勢，HDL -C 水平有降低趨勢但無顯著性差異，肝組織TG、TC、MDA 水平也顯著升高，SOD 水平有降低的趨勢但無顯著性差異。提示NAFLD 模型大鼠出現(xiàn)一定程度的肝功能異常、血脂升高、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及胰島素抵抗，基本符合人類NAFLD 的特點(diǎn)。給藥后巴日巴德-10 可顯著降低NAFLD 模型大鼠血清TG、AST、FFA、FIRI、LDL-C 水平以及肝組織TG、TC、MDA 水平。表明蒙藥巴日巴德-10 可在一定程度上降低NAFLD 模型大鼠血脂水平，改善肝功能損傷和胰島素抵抗，同時(shí)還具有一定抗氧化能力，改善氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。以上結(jié)果提示用蒙藥巴日巴德-10 治療NAFLD 可能與其改善肝功能、降血脂、抗氧化作用以及改善胰島素抵抗有關(guān)，為揭示“三根調(diào)節(jié)法”(抑“赫依”、清“希拉”、祛“巴達(dá)干”)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為了進(jìn)一步探索蒙醫(yī)藥治療NAFLD 的機(jī)制我們應(yīng)做更深一步的研究。

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