趙 軍，劉睿菲

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040)

近年來實驗研究表明針刺對腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護作用，其機制與抗氧自由基、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮損傷修復(fù)網(wǎng)絡(luò)功能有關(guān)［1-3］?！邦^四關(guān)穴”是雙側(cè)太陽穴和風(fēng)池穴的總稱，是臨床上針刺治療腦血管疾病的常用穴位。前期的實驗結(jié)果顯示，電針“頭四關(guān)穴”能夠增加腦中HSP70 蛋白的表達，減少神經(jīng)細胞凋亡，從而對腦缺血再灌注損傷家兔起到神經(jīng)保護作用。為進一步探討其對神經(jīng)細胞的保護機制，筆者進行如下研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性新西蘭白兔，清潔級，4 ～5 月齡，體重2.5 ～3.0 kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為3 組： 為假手術(shù)組、模型組和針刺組，每組又隨機分為1 天、3 天和7 天3 個時間點。所有動物自由進食和水，12 h 晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

Bcl-2、c-fos 和Caspase-3 免疫組化一抗，購自武漢博士德生物工程有限公司； PV 二步法試劑和DAB 顯色劑，購自北京中杉金橋生物公司； 其它為國產(chǎn)分析純。

德國菜卡2135 型組織切片機； 美國motic 公司moticam3000 顯微攝影成像系統(tǒng)； Image- pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)；上海安亭臺式離心機。

1.3 動物模型的制備

參考相關(guān)文獻［4］，采用線栓法建立家兔局灶腦缺血再灌注損傷模型。先將直徑0.285 mm 的3 號尼龍線剪成10 cm 長，在距一端0.5 ～1.0 cm 處，均勻涂上硅橡膠，控制線栓頭端直徑在0.51 ～0.55 mm 左右，并在距離線栓頭端6.0 cm 處做標記。

家兔術(shù)前禁食12 h，稱重后自耳緣靜脈緩慢注射20 g/L 的烏拉坦(5 ml/kg) 麻醉，常規(guī)消毒后頸部正中切口，暴露出左側(cè)頸總動脈( CCA) 及分叉，并分離出近段頸外動脈( ECA) 和頸內(nèi)動脈( ICA) 。暫時夾閉CCA 和ICA，結(jié)扎ECA 并于近端將其剪斷，將線栓經(jīng)ECA 殘端向ICA 內(nèi)緩緩送入，松開ICA 動脈夾。當線栓進入大腦中動脈( MCA) 起始部遇阻力時停止，記錄造成大腦中動脈閉塞( MCAO) 時間。記算線栓插入深度，并將ECA 殘端及線栓一同結(jié)扎固定。再灌注時，用鑷子夾住線栓外露殘端輕輕向外拉出，遇到明顯阻力感停止牽拉，記錄時間作為再灌注開始時間。結(jié)扎頸內(nèi)動脈，徹底止血后縫合切口。

假手術(shù)組家兔除不栓塞大腦中動脈外，余處理同模型組和針刺組。參照文獻［5］中的評分法，0 分：無神經(jīng)缺損癥狀；1 分： 右前肢屈曲；2 分： 向右旋轉(zhuǎn)；3 分：向右傾倒；4 分： 不能行走或昏迷。1 ～4 分為有效模型，納入實驗分組。

1.4 干預(yù)方法

參考實驗針灸學(xué)［6］，選取家兔“頭四關(guān)穴”： 雙側(cè)太陽穴和風(fēng)池穴。用1.5 寸毫針，太陽穴水平向后斜刺，進針深度5 mm，風(fēng)池穴向后下方斜刺，深度5 mm。雙側(cè)太陽及雙側(cè)風(fēng)池穴連接電針儀，頻率2 Hz，連續(xù)波，刺激強度以針柄震顫且家兔安靜不掙扎為度，治療時間為30 min。針刺組在造模成功后6 h 開始首次針刺，各時間點療程分別為1 天、3 天和7 天，每日1 次。假手術(shù)組和模型組家兔除不針刺外，每天同樣抓取。

1.5 指標檢測

各組家免于相應(yīng)時間點烏拉坦(5 ml/kg) 麻醉后，心臟取血分離血清。然后用4%的多聚甲醛PBS 液進行心臟灌注固定后取腦，自視交叉向前后各取2.5 mm厚的冠狀腦片，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片備用。

免疫組化PV 二步法檢測腦組織Bcl-2、c-fos 和Caspase-3 蛋白表達，嚴格按說明書進行操作。免疫組化分析采用Image-pro plus6.0 病理圖像分析系統(tǒng)，每張切片于梗死灶周圍選擇10 個表達最強的高倍視野(400 倍) 計算陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點腦組織中Bcl-2 蛋白表達

腦組織中Bcl-2 蛋白主要表達在神經(jīng)元胞質(zhì)中，陽性細胞呈現(xiàn)淡黃色、黃色或棕黃色。假手術(shù)組腦組織中Bcl-2 陽性神經(jīng)元數(shù)很少，模型組各時間點腦組織中陽性細胞數(shù)明顯增高，在1 天時表達最高，然后逐漸降低，與假手術(shù)組相比，差異均具有統(tǒng)計意義，P ＜0.01；而針刺組各時間點腦組織中陽性神經(jīng)元細胞數(shù)均明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.01。結(jié)果見表1。

表1 腦組織Bcl-2 蛋白表達的陽性細胞數(shù)(個/400 倍視野)比較( ±s，n=6)

表1 腦組織Bcl-2 蛋白表達的陽性細胞數(shù)(個/400 倍視野)比較( ±s，n=6)

注：與假手術(shù)組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01； 與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別 再灌注1 天 再灌注3 天 再灌注7天假手術(shù)組6.17 ±1.47 6.83 ±1.36 6.00 ±1.41模型組 25.83 ±1.51## 19.66 ±2.16## 15.83 ±1.43##針刺組 34.00 ±2.82##▲▲27.12 ±1.78##▲▲ 22.67 ±1.75##▲▲

2.2 各組不同時間點腦組織中c-fos 蛋白表達

腦組織中c-fos 蛋白主要表達在神經(jīng)元胞質(zhì)中，陽性細胞呈現(xiàn)淡黃色、黃色或棕黃色。假手術(shù)組腦組織中c-fos 陽性細胞數(shù)極低；模型組各時間點腦組織中c-fos 陽性細胞數(shù)顯著高于假手術(shù)組，在1 天時表達最高，以后逐漸降低，與假手術(shù)組相比，差異均具有統(tǒng)計意義，P ＜0.01； 針刺組各時間點腦組織中c-fos陽性細胞數(shù)較模型組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.01。結(jié)果見表2。

表2 腦組織c-fos 蛋白表達的陽性細胞數(shù)(個/400 倍視野)比較( ±s，n=6)

表2 腦組織c-fos 蛋白表達的陽性細胞數(shù)(個/400 倍視野)比較( ±s，n=6)

注：與假手術(shù)組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01； 與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別 再灌注1 天 再灌注3 天 再灌注7天假手術(shù)組8.50 ±1.05 7.16 ±1.47 6.17 ±1.72模型組 33.67 ±2.94## 28.51 ±1.87## 23.49 ±1.87##針刺組 24.50 ±1.64##▲▲20.38 ±1.72##▲▲ 14.16 ±1.48##▲▲

2.3 各組不同時間點腦組織中Caspase-3 蛋白表達

腦組織中Caspase-3 蛋白主要表達在神經(jīng)元胞質(zhì)中，陽性細胞呈現(xiàn)淡黃色、黃色或棕黃色。假手術(shù)組腦組織中Caspase-3 陽性細胞數(shù)極低； 模型組各時間點腦組織中Caspase-3 陽性細胞數(shù)顯著高于假手術(shù)組，在1 天時表達最高，以后逐漸降低，與假手術(shù)組相比，差異均具有統(tǒng)計意義，P ＜0.01； 針刺組各時間點腦組織中c-fos 陽性細胞數(shù)較模型組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.01。結(jié)果見表3。

表3 腦組織Caspase-3 蛋白表達的陽性細胞數(shù)(個/400 倍視野)比較( ±s，n=6)

表3 腦組織Caspase-3 蛋白表達的陽性細胞數(shù)(個/400 倍視野)比較( ±s，n=6)

注：與假手術(shù)組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01； 與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別 再灌注1 天 再灌注3 天 再灌注7天假手術(shù)組10.34 ±1.75 10.67 ±2.81 9.83 ±1.47模型組 32.17 ±3.31## 26.67 ±2.16## 21.65 ±2.07##針刺組 23.81 ±1.52##▲▲18.12 ±1.43##▲▲14.25 ±2.26##▲▲

3 討論

腦缺血再灌注損傷的病理機制十分復(fù)雜，近年來研究認為腦缺血再灌注損傷中細胞凋亡是神經(jīng)細胞死亡的重要形式［7］，而如何有效地減少缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡成為重要的保護機制之一。腦缺血后缺血中心區(qū)域的神經(jīng)元很快出現(xiàn)死亡，而缺血周圍區(qū)的神經(jīng)元卻發(fā)生細胞凋亡，其中bcl-2、c-fos 和Caspase-3 在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。興奮性氨基酸、Ca2+和氧自由基等也參與細胞凋亡過程［8］。

Bcl-2 具有抑制凋亡的作用，其在腦內(nèi)的過量表達可增強腦組織對缺血性損傷的耐受性，提高神經(jīng)細胞存活能力。Bcl-2 可以與Bax 競爭結(jié)合形成異源二聚體，阻止ctyc 穿過線粒體膜進入細胞質(zhì)，從而抵抗細胞凋亡［9］。有研究表明，針刺可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2 和bax 表達，從而減輕腦缺血再灌注后的神經(jīng)細胞凋亡［10-11］； 本實驗的結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白在假手術(shù)組腦組織中呈低表達，缺血再灌注后不同時間點Bcl-2 蛋白均出現(xiàn)高表達，這是損傷的機體對抗細胞凋亡的一種反應(yīng)。針刺組家兔腦組織中Bcl-2 蛋白的表達明顯高于模型組。說明針刺頭四關(guān)穴可能通過上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達從而對腦缺血再灌注所造成的損傷起到一定的保護作用。

c- fos、c- jun 等基因在腦缺血過程中較早表達［12］。c-fos 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與細胞周期調(diào)控，并能阻斷細胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)而導(dǎo)致細胞凋亡，是評價腦缺血再灌注時細胞代謝變化的重要指標。正常情況下c-fos 在腦內(nèi)呈現(xiàn)出低表達，在缺血缺氧等條件刺激下神經(jīng)細胞c-fos 高表達，其產(chǎn)物c-fosmRNA 和fos 轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與c-jun 產(chǎn)物蛋白形成異源二聚體來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮第三信使的作用。腦缺血再灌注時多種因素共同參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c- fos的表達過程，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。本實驗中觀察針刺組家兔腦組織c-fos 蛋白的表達水平有所降低，表明針刺頭四關(guān)穴可能是通過下調(diào)c-fos 蛋白的表達而實現(xiàn)對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

Caspase-3 是促凋亡基因，在正常人腦神經(jīng)元中無表達或低表達，而在腦缺血時表達明顯升高［13］。Caspase-3 是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，它的激活是腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡關(guān)鍵步驟［14-15］。實驗研究表明，缺血1 ～2 h 再灌注24 h ～46 h 后，腦組織中Caspase-3 表達增強，細胞凋亡數(shù)目也相應(yīng)增多［16-18］。本實驗的結(jié)果顯示Caspase-3 蛋白在腦缺血再灌注不同時間點，其表達水平均有不同程度提高，表明在缺血再灌注損傷過程中發(fā)生了神經(jīng)細胞凋亡。針刺干預(yù)后，Caspase-3 蛋白的表達水平都顯著下降，表明針刺頭四關(guān)穴可抑制其表達。

筆者推測腦缺血再灌注時，在能量代謝和氧自由基等內(nèi)源性物質(zhì)的刺激下，Ca2+的大量釋放，誘導(dǎo)cfos 高表達，引起Caspase-3 介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，從而加速了神經(jīng)細胞凋亡。同時Bcl-2 表達明顯增加，抑制了Ca2+的釋放，發(fā)揮抗細胞凋亡作用。針刺頭四關(guān)穴可以通過改變腦缺血區(qū)血液流變學(xué)、增加血液供應(yīng)和改善腦組織能量代謝等途徑，上調(diào)Bcl-2 蛋白水平、下調(diào)c-fos 蛋白和Caspase-3 蛋白水平從而抑制細胞凋亡，減輕腦組織的損傷。

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