李翠芳，趙凌艷，肖 麗

(十堰市太和醫(yī)院 附屬湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰442000)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一類原因不明好發(fā)于四肢關節(jié)、心臟等器官的自身免疫性疾病，臨床病理改變以四肢關節(jié)滑膜慢性炎癥為主，常累及關節(jié)軟骨滑膜及骨質［1］。其病因主要為軟骨的破壞與變性，是軟骨分解與合成代謝失衡的結果［2］，此類疾病多發(fā)于中年以后的慢性、退行性關節(jié)疾病，膝關節(jié)腔多伴有大量積液為多見，臨床以四肢(膝關節(jié)為甚)疼痛、變形和活動受限為特點。臨床特征為關節(jié)結構的炎癥和腫脹、慢性進行性病程，并可致多個關節(jié)完全強直，骨質疏松及關節(jié)畸形，并最終導致關節(jié)功能的喪失，目前尚無理想的治療方法。中醫(yī)認為膝骨性關節(jié)炎屬“痹證”，“風、寒、濕”合而成痹，此類患者常挾濕氣下注于關節(jié)［3］。由于軟骨分解及合成代謝失衡及筋絡脈隧痹阻不通，多繼發(fā)滑膜與滑液炎，其病理改變多以膝關節(jié)滑膜受損及關節(jié)腔積液為主［4］，本實驗電針配合穴位注射骨瓜提取物注射液治療類風濕關節(jié)炎，旨在挖掘祖國中醫(yī)藥治療關節(jié)炎優(yōu)勢，探討其作用機制，以期研究聯(lián)合治療的鎮(zhèn)痛消炎作用機制，為臨床提供安全可靠的治療膝骨關節(jié)炎合并關節(jié)腔積液治療方案。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

日本大耳白兔40 只，體質量(2500 ±50)g，雌雄兼用，實驗動物由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(鄂)2011-0008;實驗動物設施使用許可證:SYXK(鄂)2011-0031。采用隨機數(shù)字表編號，隨機分為模型組、電針組、骨瓜提取物組及聯(lián)合治療組，每組10 只。

1.2 儀器設備及試劑

骨瓜提取物注射液(哈爾濱圣泰生物制藥有限公司，批準文號:國藥準字H23023507);小牛軟骨Ⅱ型膠原加福氏完全佐劑(上海實生細胞生物技術有限公司)。SDZ-II 型電子針療儀(上海坤弘，型號:SDZ-II)。

1.3 類風濕關節(jié)炎動物模型制備

動物造模時先剃掉兔膝關節(jié)及以下毛發(fā)，碘伏消毒，采用日本鬼頭康彥［5］膝骨關節(jié)炎造摸法，將小牛軟骨Ⅱ型膠原加福氏完全佐劑0.1 mL 于第1、3、7 天注入右膝關節(jié)腔內，根據(jù)臨床上超疲勞容易提前出現(xiàn)關節(jié)炎的發(fā)病特點，每日強迫動物活動30 min，14 天后出現(xiàn)以下與臨床急性膝關節(jié)炎表現(xiàn)一致的癥狀即可確定大鼠急性膝關節(jié)炎模型造模成功:①關節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛、同時軟組織腫脹或積液;②關節(jié)及其周圍僵硬、活動受限;③發(fā)病的部位常見于膝、髖、踝等關節(jié)處;④關節(jié)病理切片鏡檢出現(xiàn)關節(jié)腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜粘連、增生、肥厚等膝關節(jié)炎臨床病理學改變;⑤關節(jié)積液檢查出現(xiàn)HA 降低、PGE2、IL-1β含量明顯升高。本實驗模型成功率為100%。

1.4 治療方法

術后14 天造模成功后，分別將兔固定于兔固定器，電針組以電針齊刺為主的針灸治療方法治療，取足血海、三里、陽陵泉為主穴用一次性無菌針灸針齊刺，旁開1 寸兩旁各刺1 針，其針尖與正中1 針的針尖匯合，刺入骨膜，行導氣手法，使針感向膝周擴散為佳;以齊刺點為正極，配穴為負極，接SDZ- II 型電子針療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，留針30 min。骨瓜提取物組肌肉注射骨瓜提取物1 mg/d/kg。聯(lián)合治療組取足三里、血海、陽陵泉3 穴為主穴電針刺激30 min 后穴位注射骨瓜提取物。模型組注射生理鹽水。以上各組均治療1 日1 次，連續(xù)治療14 天。

1.5 檢驗指標及檢測方法

參照文獻［6］，于治療前后分別病理檢查測定關節(jié)滑膜BMPs 及MMP-1 陽性表達率(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%)，抽取兔膝關節(jié)腔積液，測定積液IL-8、PGE2、HA 含量。

1.6 膝關節(jié)腫脹百分率的測定

采用玻璃容器排水法測量造模前及治療14 天后容積并計算左膝關節(jié)腫脹百分率。方法為:先取100 ml量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用50 ml注射器吸取量筒內蒸餾水約30 ml。于每只兔左膝關節(jié)縫矢狀面用記號筆做一標記，然后把兔左足緩慢伸人量筒內，使標記與量筒最高處平齊。再用已吸入30 ml水的注射器向量筒內緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及兔膝關節(jié)標記處一致，讀取注射器內剩余液體體積，再用30 ml-注射器內剩余液體體積即為兔的左膝關節(jié)容積，重復3 次取平均值。左膝關節(jié)腫脹百分率(%)=(造模后容積-造模前容積)/造模前容積×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結果

2.1 治療前后兩組HA、IL-1β、PGE2比較

見表1，在經(jīng)14 天治療后，模型組IL-1β、PGE2明顯升高，HA 降低，說明炎癥反應持續(xù)存在，造模成功;電針組HA 升高、IL-1β 降低，但PGE2無明顯變化;骨瓜提取物組HA 升高，IL-1β、PGE2含量明顯下降，與模型組及電針組比較(P ＜0.05)，差異顯著;聯(lián)合治療組HA 明顯升高，IL-1β、PGE2含量明顯下降，與電針組及骨瓜提取物組比較(P ＜0.05)，差異顯著。提示:聯(lián)合治療組在經(jīng)電針齊刺后穴位注射骨瓜提取物可明顯降低IL-1β、PGE2、促進HA 分泌。

2.2 治療前后BMPs、軟骨細胞MMP-1 陽性表達比較

模型組BMPs 在經(jīng)14 天治療后無明顯變化，軟骨細胞MMP-1 陽性表達明顯升高。電針組BMPs 有升高趨勢，軟骨細胞MMP-1 陽性表達則無明顯變化，與治療前比較無統(tǒng)計學意義。骨瓜提取物組BMPs 明顯升高，軟骨細胞MMP-1 陽性表達率降低，與模型組及電針組比較(P ＜0.05)，差異顯著。聯(lián)合治療組在經(jīng)電針齊刺后穴位注射骨瓜提取物，BMPs 較骨瓜提取物組升高更明顯，軟骨細胞MMP-1 陽性表達率進一步降低，與電針組及骨瓜提取物組比較(P ＜0.05)，差異顯著，見表2。

2.3 治療前后各組動物足腫脹度、消腫時間比較

見表3，電針組足腫脹度、消腫時間均有一定的降低，與模型組及本組治療前比較，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。骨瓜提取物組腫脹度、消腫時間較電針組明顯縮短，與模型組及電針組比較，P ＜0.05。聯(lián)合治療組則明顯優(yōu)于電針組及骨瓜提取物組，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

表1 治療前后兩組HA、IL-1β、PGE2比較 (±s，n=10)

表1 治療前后兩組HA、IL-1β、PGE2比較 (±s，n=10)

注:與治療前比較，△P ＜0.05;與模型組比較，▲P ＜0.05;與電針組比較，#P ＜0.05;與骨瓜提取物組比較，* P ＜0.05。

組別HA(μg/L)IL-1β(pg/ml)PGE2(OD)治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后模型組 1.39 ±0.20 0.93 ±0.12△ 34.24 ±4.50 50.57 ±6.11△ 0. 92 ±0.09 1.87 ±0.28△電針組 1.43 ±0.21 3.85 ±0.56△▲ 35.29 ±4.33 21.38 ±2.97△▲ 0. 90 ±2.87 0.86 ±0.05骨瓜提取物組 1.40 ±0.19 4.79 ±0.71▲# 34.47 ±4.06 22.29 ±2.83▲# 0. 93 ±0.09 0.57 ±0.06▲#聯(lián)合治療組 1.42 ±0.22 6.79 ±0.84#* 36.21 ±4.41 14.36 ±2.45#* 0. 91 ±0.08 0.19 ±0.02#*

表2 治療前后各組動物BMPs、MMP-1 比較(±s，n=10)

表2 治療前后各組動物BMPs、MMP-1 比較(±s，n=10)

注:與治療前比較，△P ＜0.05;與模型組比較，▲P ＜0.05;與電針組比較，#P ＜0.05;與骨瓜提取物組比較，* P ＜0.05。

組別BMPs(ng/L)MMP-1(%)治療前 治療后 治療前 治療后模型組7.08±0.73 7.31±0.67 21.01±3.35 29.91±4.01電針組 6. 87±0.61 7.92±0.54 21.93±3.23 19.34±2.41骨瓜提取物組 7.14±0.65 10.62±0.79▲# 20.97±3.17 13.37±2.22▲#聯(lián)合治療組 7.03±0.57 13.43±1.94#* 22.01±3.41 8.97±1.04#*

表3 治療前后各組動物足腫脹度、消腫時間比較(±s，n=10)

表3 治療前后各組動物足腫脹度、消腫時間比較(±s，n=10)

注:與治療前比較，△P ＜0.05;與模型組比較，▲P ＜0.05;與電針組比較，#P ＜0.05;與骨瓜提取物組比較，* P ＜0.05。

組別 足腫脹度(%)消腫時間(天)治療前 治療后 治療前 治療后模型組 35.92±3.78 39.21±4.02 14.21±2.31 13.57±1.95電針組 34.41±3.23 28.34±3.05△▲13.29±2.51 10.31±2.41△▲骨瓜提取物組36.29±3.52 21.39±2.42▲#14.41±2.27 8.34±1.42▲#聯(lián)合治療組 35.54±3.23 10.30±1.49#* 13.02±2.10 6.33±1.09#*

3 討論

中醫(yī)認為，當膝關節(jié)因外傷或其他原因受損傷后，局部關節(jié)血瘀氣滯，濕濁之氣痹阻于膝，治則當針灸以舒筋通絡、行氣止痛，中藥活血化瘀、利濕除痹而達到臨床治愈的目的［7］。類風濕關節(jié)炎以四肢特別膝關節(jié)伴關節(jié)積液多見，其病理改變以關節(jié)腔及滑膜炎性浸潤，造成關節(jié)面軟骨被破壞、變性并繼發(fā)滑液炎癥，是關節(jié)軟骨細胞的分解與合成代謝紊亂造成的慢性、退行性關節(jié)疾?。?］。臨床上多發(fā)于35 歲以上的中年人，臨床以膝關節(jié)疼痛、變形和活動受限為主要特點，目前治療辦法多以抗炎消腫為主，但療效并不理想［9］。

HA 是關節(jié)滑液和軟骨基質的重要組成部分，主要為由N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖和D-葡萄糖醛酸有規(guī)律重復構成的大分子鏈狀多糖，HA 可抑制類風濕關節(jié)炎時關節(jié)腔內IL-1β 及PGE2等炎性介質的合成及擴散，降低滑膜的通透性，減少關節(jié)腔內滲液滲出［10］。IL-1β、PGE2是機體的主要炎癥因子，正常情況關節(jié)中可檢出微量IL-1β、PGE2，在患類風濕性疾病時，IL-1β 及PGE2含量則會異常增高。正常關節(jié)滑液和軟骨中BMPs 分化較高，MMP-1 細胞陽性表達極低。故本實驗研究采用電針配合穴位注射骨瓜提取物治療類風濕性關節(jié)炎動物模型，以HA、IL-1β、PGE2、BMPs 及MMP-1 細胞陽性表達率為主要生化指標來衡量該治療方案的療效。

實驗中選用日本大耳白兔血海、足三里、陽陵泉3穴，是因為陽陵泉可強筋祛濕，主治膝痹;足三里具有養(yǎng)血益氣之功效，主治下肢痿痹;而血海穴主活血，與陽陵泉及足三里配伍具有舒筋活絡、利通關節(jié)之效［11］。結果顯示，聯(lián)合治療組兔在經(jīng)過14 天電針血海、足三里、陽陵泉后，PGE2、MMP-1 細胞陽性表達率、足腫脹度及消腫時間均有不同程度的降低和縮短，這可能與電針刺激可激發(fā)經(jīng)氣、促進局部血液循環(huán)及局部病變組織新陳代謝、降低痛閾、減輕關節(jié)滑膜表面神經(jīng)神經(jīng)末梢對炎性因子IL-1β、PGE2刺激的反應敏感度有關。本實驗結果與周效思等［12］研究威靈仙能明顯延長小鼠熱板痛閾時間和顯著減少小鼠扭體反應的次數(shù)相吻合。聯(lián)合治療組兔在配合外敷威靈仙浸膏，HA 較單用電針刺激及威靈仙外敷增高明顯，IL-1β、PGE2及MMP-1 進一步降低，這可能是威靈仙浸膏外敷后通過皮膚吸收，促使滑膜內襯B 型滑膜細胞和單核吞噬細胞大量分泌HA，以達到潤滑關節(jié)、延緩軟骨退變及保護關節(jié)軟骨的作用。同時，中藥吸收后還可抑制機體產(chǎn)生過多的IL- lB 及PGE2等炎癥因子，降低滑膜的通透性及因炎癥刺激而造成MMP-1細胞陽性表達，這對減輕IL-1β 及PGE2等對關節(jié)軟骨細胞的破壞、減少關節(jié)內滲出液及炎性反應起到至關重要的作用。

由于骨瓜提取物注射液中富含多種游離氨基酸，為成骨細胞合成BMPs、TGF-β 等骨源性生物因子提供能量和原料，促進骨源性生物因子的合成。實驗證實骨瓜提取物注射液中的多肽類骨代謝因子增加BMPs 的合成，抑制MMP-1 過度表達。本研究認為其促進BMPs 的合成的主要藥理作用是促進成骨細胞有絲分裂及趨化作用［13］。BMPs 作為一種骨誘導因子，是間充質細胞向骨系細胞轉化的信號傳導介質，具有誘導間充質細胞轉化為成骨細胞和軟骨細胞的作用。同時，BMPs 還可通過調節(jié)TGF-β 和FGF 而誘導新骨形成，從而促進鈣、磷代謝，增加骨鈣沉積，防治和改善骨質疏松的發(fā)生［14］。骨瓜提取物注射液中的甜瓜籽提取物能降低關節(jié)局部毛細血管通透性，減少IL- 1β 合成及炎性滲出，降低因炎癥刺激而造成MMP-1 細胞陽性表達，促進局部炎癥及組織粘連時血運障礙的恢復，改善關節(jié)局部的血液循環(huán)?？傊?，骨瓜提取物注射液通過調節(jié)關節(jié)積液中HA 及IL-1β含量、滑膜BMPs 及MMP-1 陽性表達，影響關節(jié)及骨代謝，刺激成骨細胞增殖，調節(jié)鈣、磷代謝，增加鈣沉積，防治骨質疏松［15］，縮短消腫時間，清除關節(jié)腔內炎性因子而起到活血化瘀、祛風除濕、消腫抗炎鎮(zhèn)痛的目的，改善關節(jié)腔內環(huán)境而達“通則不痛”的功效［16］。

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