王劍歌，李巖，周震，陸軍，劉保紅，蔡志敏，程素利，周智梁

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.天津市公安醫(yī)院，天津300042;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300150)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種常導(dǎo)致患者殘疾或死亡的損傷性疾病，給無數(shù)家庭帶來極大痛苦。因此對(duì)于脊髓損傷的恢復(fù)，尤其是組織結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能恢復(fù)的研究逐漸成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。本研究通過建立急性SCI 模型大鼠，在不同時(shí)段運(yùn)用Basso-Beattic-Bresnahan 行為功能評(píng)分(BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分)［1］，采用透射電鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，觀察火針療法對(duì)SCI 模型大鼠神經(jīng)功能缺損恢復(fù)程度和脊髓神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD 雄鼠，重約260 ～300 g。由中國食品藥品檢定研究所提供(許可證號(hào):SCXK(京)2009-0017);標(biāo)準(zhǔn)條件統(tǒng)一喂養(yǎng)。天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)、觀測(cè)、造模、取材。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HITACHI H-7500 透射電子顯微鏡(Electron Microsope)(日本制造);超薄切片機(jī)LKB-III

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

20 g/L 戊巴比妥鈉;2.5%戊二醛;二甲砷酸鈉緩沖液;1%鋨酸;酒精。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

本實(shí)驗(yàn)通過隨機(jī)對(duì)照盲法，將大鼠分為火針治療組、脊髓損傷對(duì)照組、空白組和假手術(shù)組，其中火針治療組和脊髓損傷對(duì)照組每組又分為1 天、3 天、7 天、10天、14 天5 個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段各10 只。

2.2 模型制備

采用改良的Allen's 法制備急性SCI 動(dòng)物模型［2］，術(shù)后飼養(yǎng)大鼠謹(jǐn)防感染，每天常規(guī)擠壓膀胱排尿3 次，直到反射性膀胱排空形成。

2.3 治療方法

本實(shí)驗(yàn)穴位選取參考《動(dòng)物針灸穴位圖譜》及《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》。具體穴位為T7、T8、T11、T12棘突下兩側(cè)的華佗夾脊穴。

火針針刺方法:穴位常規(guī)消毒后，左手持酒精燈，右手持火針。加熱針體至通紅后向選好的穴位速刺，每穴刺一針，共8 穴，深度為3 ～5 mm。

2.4 電鏡標(biāo)本提取

大鼠處死后于冰上取大鼠損傷部位脊髓，投入4℃2.5%戊二醛固定液中固定2 h;二甲砷酸鈉緩沖液沖洗;1%鋨酸4℃固定2 h;ddH2O 沖洗;梯度酒精脫水;環(huán)氧丙烷置換;Epon812 包埋;包埋塊修整;取1 μm半薄切片，天青-美蘭染色，光學(xué)顯微鏡定位;醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。

2.5 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

在各評(píng)分時(shí)間點(diǎn)將大鼠排空膀胱后對(duì)其進(jìn)行BBB 評(píng)分。首先將動(dòng)物置于2 m2的光滑平地，使其自主運(yùn)動(dòng)5 min，然后參照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。滿分為21 分，共分3 項(xiàng)。第一項(xiàng)為0 ～7 分，對(duì)大鼠下肢各個(gè)關(guān)節(jié)活動(dòng)進(jìn)行評(píng)判;第二項(xiàng)為8 ～13 分，評(píng)判下肢的步態(tài)及是否協(xié)調(diào);第三項(xiàng)為14 ～21 分，評(píng)判爪的精細(xì)動(dòng)作。運(yùn)動(dòng)功能越好則得分越高。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，檢驗(yàn)方法為非參數(shù)檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異具有顯著性意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 BBB 評(píng)分結(jié)果

大鼠BBB 評(píng)分見表1。從術(shù)后3 天開始，火針治療組與脊髓損傷對(duì)照組評(píng)分結(jié)果均逐漸升高，并持續(xù)到術(shù)后14 天，但火針治療組評(píng)分均高于脊髓損傷對(duì)照組。

表1 大鼠各個(gè)時(shí)間段運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能BBB 評(píng)分比較

3.2 電鏡觀察

假手術(shù)組與空白組的有髓神經(jīng)纖維髓鞘排列規(guī)則，板層致密，髓索結(jié)構(gòu)正常，與髓鞘之間無間隙。內(nèi)容物線粒體、微絲、微管數(shù)量正常。神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，含有高爾基復(fù)合體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、尼氏體、神經(jīng)原纖維和溶酶體等結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核大而圓，核膜完整，核染色質(zhì)顆粒細(xì)致，分布均勻。

脊髓損傷對(duì)照組顯示大量有髓神經(jīng)髓鞘分層水腫，髓索明顯縮小，線粒體、微絲、微管明顯減少，見封三圖1。

神經(jīng)元細(xì)胞膜局部缺如，細(xì)胞質(zhì)輕度水腫，細(xì)胞器數(shù)量減少，線粒體部分嵴和少部分膜溶合，模糊不清，嵴有缺失和空化現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度溶合和脫顆?，F(xiàn)象，游離核糖體數(shù)量減少，見封三圖2。

火針治療組顯示有髓神經(jīng)髓鞘分層水腫，髓索明顯縮小，線粒體、微絲、微管明顯減少，見封三圖3。

神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)輕度水腫，細(xì)胞器數(shù)量減少，線粒體部分嵴和少部分膜溶合，模糊不清，可見嵴有缺失現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度溶合和脫顆粒現(xiàn)象，游離核糖體數(shù)量減少，核形狀比較整齊，核膜、核仁較正常，見封三圖4。

4 討論

研究提示，初級(jí)神經(jīng)元的損失是神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能障礙的最根本的原因，并且神經(jīng)元的存活是神經(jīng)損傷后再生修復(fù)的先決條件［3］。在脊髓損傷模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定方面，本實(shí)驗(yàn)選擇BBB 評(píng)分。其特點(diǎn)是包括了SCI 后大鼠后肢恢復(fù)過程中所有行為變化，與脊髓損傷的程度相符度高，且評(píng)分者在評(píng)分時(shí)主觀因素少［4］。

火針療法，古代稱為“焠刺”，不同于毫針的特點(diǎn)是需要將針體加熱燒紅后，再進(jìn)行針刺。《靈樞·官針》云:“焠刺者，刺燔針則取痹也?！奔顾钃p傷屬于中醫(yī)“痿證”、“痹癥”。脊髓損傷后臨床癥狀多是因?yàn)槎矫}不通、氣滯血瘀。火針可以行氣活血、溫通經(jīng)脈，在臨床應(yīng)用中對(duì)于多種疾病具有顯著療效，尤其是痹證［5］。華佗夾脊穴與督脈相連，針刺可以直達(dá)病所，同時(shí)避免了直接刺激督脈腧穴出現(xiàn)損失脊髓的可能性。因此，火針針刺華佗夾脊穴安全、有效，一定程度上減輕了脊髓損傷的臨床癥狀?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)火針能夠促進(jìn)脊髓損傷大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子陽性神經(jīng)元的表達(dá)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能的恢復(fù)［6］，且火針干預(yù)的血清能夠誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化［7］。

本研究結(jié)果提示，脊髓損傷后的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分與電鏡下脊髓的組織結(jié)構(gòu)變化具有相關(guān)一致性。火針治療后大鼠功能恢復(fù)程度與脊髓損傷對(duì)照組相比有顯著性差異，電鏡下火針治療組大鼠脊髓損傷部位可見神經(jīng)元胞核和神經(jīng)纖維修復(fù)再生，表明火針可以促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

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