曹秋實(shí), 楊 柳, 巴元明, 羅俊華,3, 陳偉棟,4

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061； 2. 湖北省中醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430061；3. 廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院干部病房一科，湖北 武漢 430070； 4. 武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

?

·基礎(chǔ)研究·

IPP在草酸鈣結(jié)晶評(píng)分中應(yīng)用的可行性研究

曹秋實(shí)1, 楊 柳1, 巴元明2, 羅俊華1,3, 陳偉棟1,4

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061； 2. 湖北省中醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430061；3. 廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院干部病房一科，湖北 武漢 430070； 4. 武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

目的 探究IPP圖像分析軟件評(píng)估結(jié)晶情況可行性、可靠性和穩(wěn)定性。方法 由兩位研究員分別對(duì)同一批草酸鈣結(jié)晶照片進(jìn)行人工評(píng)分和應(yīng)用IPP評(píng)分，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)評(píng)分的一致性；1周后，一位研究員再次進(jìn)行人工評(píng)分和應(yīng)用IPP評(píng)分，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)自身前后評(píng)分的一致性。結(jié)果 人工評(píng)分草酸鈣結(jié)晶，兩位研究員及同一研究員前后所給的評(píng)分，其一致性均差；應(yīng)用IPP評(píng)分，兩位研究員及同一研究員前后所給的評(píng)分，其一致性均較高。結(jié)論 應(yīng)用IPP圖像分析軟件對(duì)草酸鈣結(jié)晶情況進(jìn)行評(píng)分具有可靠性和穩(wěn)定性。

Image-Pro Plus； 草酸鈣結(jié)晶； 評(píng)分

尿路結(jié)石是一種常見的疾病，患病率為1%～15%[1]，治療后易復(fù)發(fā)，10年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%[2]，嚴(yán)重影響人體的健康。尿路結(jié)石中，75%～85%為含鈣結(jié)石，而草酸鈣結(jié)石又占含鈣結(jié)石的92%[3]。在各種有關(guān)尿路結(jié)石的研究中，觀察腎組織中草酸鈣結(jié)晶形成情況，是目前較為客觀的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。通過對(duì)腎組織中草酸鈣結(jié)晶的觀察就可以直觀判斷草酸鈣結(jié)石造模的成功與否，通過對(duì)結(jié)晶數(shù)目、形態(tài)、分布的可以探討草酸鈣結(jié)石的形成機(jī)制，通過判定結(jié)晶評(píng)分多少就可以就可評(píng)價(jià)不同藥物在抑制結(jié)晶形成及促進(jìn)結(jié)晶排出療效。

草酸鈣結(jié)晶評(píng)分是尿路結(jié)石的實(shí)驗(yàn)研究中非常重要的內(nèi)容，是對(duì)結(jié)石形成程度的量化評(píng)估，由研究者在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟切片中結(jié)晶情況，并按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)作出評(píng)分[4]。目前，實(shí)驗(yàn)中多采用人工評(píng)分法，通過形態(tài)分級(jí)[5]、計(jì)數(shù)分級(jí)[6]等判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，該方法受觀察者主觀因素影響較大，而且較為粗略，可靠性和穩(wěn)定性并不理想。

Image-Pro Plus(IPP)[7]是Media Cybernetics公司研發(fā)的圖像分析軟件包，是一個(gè)集圖像獲取、處理、分析于一身的開發(fā)平臺(tái)[8]，可以對(duì)所得圖像進(jìn)行客觀、定量、準(zhǔn)確分析。因此，為實(shí)現(xiàn)草酸鈣結(jié)晶評(píng)分的客觀化、定量化和精確化，本研究采用IPP圖像分析軟件，對(duì)草酸鈣結(jié)石大鼠模型的腎臟Von Kossa染色切片進(jìn)行分析處理，研究其能否在精確、客觀、定量評(píng)估結(jié)晶情況，并分析其應(yīng)用的可行性、可靠性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

IPP 6.0購自Media Cybernetics公司；Nikon Eclipse 80i科研級(jí)顯微鏡及附帶NIS-Elements專業(yè)圖像分析軟件購自日本尼康公司。乙二醇、氯化銨、草酸銨均為分析純。乙二醇(批號(hào)20121206)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化銨(批號(hào)20120612)購自天津永大化學(xué)試劑有限公司；石蠟切片馮庫薩(Von Kossa)鈣染色試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。SPF級(jí)雄性健康Wistar大鼠15只由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，體質(zhì)量180～220g，合格證： SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、治療組，每組5只?？瞻讓?duì)照組(簡稱空白組)給予常規(guī)飼料+去離子水喂養(yǎng)，每天1ml生理鹽水灌胃；模型組給予常規(guī)飼料+1%乙二醇自由飲水，每天2%氯化銨2ml灌胃[3]；治療組在造模的基礎(chǔ)上給予每天25%枸櫞酸鉀 2ml 灌胃。各組大鼠均在相同的條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期為28d。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠稱重，10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)腹取左腎置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，作常規(guī)切片(厚度為 2μm)，每只大鼠選取5張切片，共75張。每張切片由研究人員在200倍視野、同一光源、亮度及對(duì)比度條件下，在腎皮質(zhì)處隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，以5個(gè)每視野的平均值來表示該片的結(jié)晶情況。

1.3 評(píng)分方法

分別采用人工評(píng)分法和IPP軟件評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分，按國內(nèi)多采用形態(tài)分級(jí)作為判定標(biāo)準(zhǔn)[5]，即0分： 無結(jié)晶，1分： 有散在的結(jié)晶亮點(diǎn)，2分： 廣泛的不成堆或局限結(jié)晶，3分： 有成堆結(jié)晶散在不連接，4分： 結(jié)晶成堆且互相連接，5分： 廣泛成堆結(jié)晶，連接成片。

1.3.1 人工對(duì)草酸鈣結(jié)晶評(píng)分 按照盲法要求，對(duì)375張切片圖像進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，由兩位研究員分別觀察每張圖像中的結(jié)晶分布和數(shù)量情況，按上述評(píng)分方法評(píng)分，記錄每人觀察評(píng)分的分值及所用時(shí)間。比較兩人評(píng)分差異，并作一致性檢驗(yàn)。1周后，其中一位研究員再次對(duì)圖像觀察評(píng)分，比較其兩次評(píng)分的差異，檢驗(yàn)其一致性。

1.3.2 IPP軟件對(duì)草酸鈣結(jié)晶評(píng)分 (1) 確定IPP測量草酸鈣結(jié)晶的最佳參數(shù)(圖1)。選出以上兩位研究員評(píng)分一致的圖像，按分值歸類后，用IPP軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)算各圖像中結(jié)晶的面積、吸光度及兩者乘積的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，比較這些參數(shù)與人工評(píng)分分值的相關(guān)性，選出相關(guān)性高的最佳參數(shù)，用聚類分析方法將最佳參數(shù)數(shù)值范圍與各人工評(píng)分分值所對(duì)應(yīng)的，使IPP測量草酸鈣結(jié)晶具有可行性。(2) 檢驗(yàn)IPP測量草酸鈣結(jié)晶可靠性和穩(wěn)定性。由兩位研究員A、B各自用IPP軟件，選取合適的RGB分色參數(shù)，并結(jié)合確定結(jié)晶測量參數(shù)，編制成“宏”，對(duì)375張圖像進(jìn)行批量測算并記錄所用時(shí)間。比較兩位研究員的RGB分色參數(shù)設(shè)置差異和確定的參數(shù)測算值差異，并作一致性檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)可靠性；其中一位研究員于一周后重復(fù)上述流程，比較其前后兩次的測算差異，并作一致性檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)穩(wěn)定性。

圖1 腎組織切片Von Kossa染色結(jié)果(×200)及IPP對(duì)草酸鈣結(jié)晶面積測量圖Fig.1 Kidney sections with Von Kossa staining (×200) andthe area of calcium oxalate crystallization measured with IPP

上半部分為腎組織切片Von Kossa染色結(jié)果，下半部分為采用IPP對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行面積測量時(shí)截圖

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

人工評(píng)分采用Kappa檢驗(yàn)進(jìn)行一致性分析；人工評(píng)分各分值對(duì)應(yīng)的最佳參數(shù)分界值確定采用快速聚類分析法[9-10]；RGB分色參數(shù)、最佳參數(shù)測算值的一致性分析采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient, ICC)檢驗(yàn)[11]。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人工對(duì)草酸鈣結(jié)晶評(píng)分情況

不同研究員的評(píng)分見表1。A、B兩位研究員分別評(píng)分的數(shù)據(jù)經(jīng)Kappa檢驗(yàn)一致性分析后，其Kappa值為0.3835，加權(quán)Kappa值為0.6718；A前后兩次的評(píng)分見表2，其Kappa值為0.4239，加權(quán)Kappa值為0.7516；結(jié)果表明： 同一批腎臟切片，兩位研究員及同一研究員前后所給的評(píng)分，其一致性均差。

表1 不同研究員評(píng)分比較

率為每行×每列的邊際頻率

表2 研究員A前后兩次評(píng)分的比較

率為每行×每列的邊際頻率

2.2 IPP測量結(jié)晶的最佳參數(shù)

用IPP軟件測量草酸鈣結(jié)晶的面積、吸光度及兩者乘積，與人工評(píng)分值進(jìn)行比較，得到Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.8826、0.7948和0.8173，故以面積作為IPP測量結(jié)晶的最佳參數(shù)；用聚類分析方法將測量結(jié)晶面積與各人工評(píng)分分值所對(duì)應(yīng)的，使IPP測量草酸鈣結(jié)晶具有可行性，具體分界值見表3。

表3 形態(tài)分級(jí)評(píng)分各分值所對(duì)應(yīng)的Area值和聚類分析方法確定的分界值

2.3 IPP采用不同RGB分色參數(shù)測量結(jié)晶的情況

A研究員選取的RGB分色參數(shù)： R為45～167，G為5～123，B為5～104；B研究員選取的RGB分色參數(shù)： R為43～167，G為3～123，B為0～104。兩者測得的結(jié)晶面積，經(jīng)方差分析，χ2=0.05，P=0.854，ICC=0.9327；A研究員前后選取的RGB分色參數(shù)后測得的結(jié)晶面積，經(jīng)方差分析，χ2=0.54，P=0.436，ICC=0.9015。結(jié)果表明： 同一批腎臟切片，兩位研究員及同一研究員前后所給的評(píng)分，其一致性較高。

2.4 人工評(píng)分與IPP評(píng)分時(shí)間的比較

人工評(píng)分375張草酸鈣結(jié)晶照片，A、B兩位研究員所用時(shí)間分別為335、350min，A研究員前后兩次所用時(shí)間分別為335、315min；應(yīng)用IPP評(píng)分375張草酸鈣結(jié)晶照片，A、B兩位研究員所用時(shí)間分別為225、235min，A研究員前后兩次所用時(shí)間分別為225、200min。結(jié)果表明： 應(yīng)用IPP進(jìn)行草酸鈣結(jié)晶評(píng)分可以縮短實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間。

3 討 論

在尿路結(jié)石的實(shí)驗(yàn)研究中，無論是建立與篩選動(dòng)物模型，探究尿路結(jié)石形成機(jī)制，還是探討藥物對(duì)尿路結(jié)石的防治效果，都需要觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物草酸鈣結(jié)晶的數(shù)量及分布情況。一般多采用鏡下觀察Von Kossa染色的腎組織切片，因?yàn)閂on Kossa染色下草酸鈣晶體呈黑褐色，與腎臟本身染色形成鮮明對(duì)比，鏡下和圖像分析軟件中均便于觀察結(jié)晶數(shù)量、形態(tài)及分布。

對(duì)于草酸鈣結(jié)晶的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的選擇，國內(nèi)多采用形態(tài)分級(jí)評(píng)分法[5]，即以結(jié)晶的形態(tài)如“點(diǎn)、堆、連接、片等”、范圍如“散在、局限、廣泛”來分級(jí)評(píng)分；國外多采用計(jì)數(shù)分級(jí)評(píng)分[6]，即以晶體的數(shù)量來分級(jí)評(píng)分。雖然與形態(tài)分級(jí)評(píng)分法比較，計(jì)數(shù)分級(jí)評(píng)分法的量化度較高，但實(shí)際觀察中，結(jié)晶多呈堆疊狀附著于腎小管，精確地結(jié)晶計(jì)數(shù)很難實(shí)現(xiàn)。本研究選擇了形態(tài)分級(jí)評(píng)分法，雖然避免立體計(jì)數(shù)的難題，但研究員對(duì)草酸鈣結(jié)晶的評(píng)分主觀性依舊很大。

近年來，IPP圖像處理軟件被廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是在免疫組化圖像分析和處理中。本研究將IPP圖像處理軟件應(yīng)用于草酸鈣結(jié)晶的評(píng)分，用聚類分析方法將形態(tài)分級(jí)評(píng)分法各分值范圍在IPP中得到量化；經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定RGB分色最佳參數(shù)設(shè)置，取R為189～212；G為206～255；B為125～255，使結(jié)晶人工選取范圍與自動(dòng)選定范圍的重合度最佳，從而使草酸鈣結(jié)晶的評(píng)分在IPP上得到客觀、定量、準(zhǔn)確的分析。

草酸鈣結(jié)晶IPP評(píng)分的應(yīng)用不僅實(shí)現(xiàn)了計(jì)算機(jī)自動(dòng)測量草酸鈣結(jié)晶面積等數(shù)據(jù)，避免了主觀性介入，提高草酸鈣結(jié)晶評(píng)分的可靠性和穩(wěn)定性，并可以通過“宏”的編制和運(yùn)用，可批量、快速測量的圖像，節(jié)約了研究時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用IPP對(duì)草酸鈣結(jié)晶進(jìn)行評(píng)分，不同位研究員用IPP對(duì)同一批結(jié)晶圖像評(píng)分及同一研究員先后對(duì)同一批圖像進(jìn)行結(jié)晶評(píng)分均顯示出高度的一致性，表明其可靠性與穩(wěn)定性遠(yuǎn)優(yōu)于人工評(píng)分。

IPP圖像處理軟件能精確、客觀、定量評(píng)估結(jié)晶情況，并驗(yàn)證了其應(yīng)用的可行性、可靠性和穩(wěn)定性，期望草酸鈣結(jié)晶IPP評(píng)分法可以得到廣泛的應(yīng)用，在尿路結(jié)石的相關(guān)研究中發(fā)揮其作用。

[1] Wein AJ, Kavoussi LR, Novick AC, et al. 坎貝爾-沃爾什泌尿外科學(xué)[M].郭應(yīng)祿,周利群,譯.北京： 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2009： 1440.

[2] Junglee N, Harries SE, Davies N, et al. Pheochrom-ocytom a in pregnancy： when is operative intervention indicated?[J].J Womens Health, 2007,16(9)： 1362- 1365.

[3] 田晶,郭宏騫,孫西釗，等.大鼠草酸鈣結(jié)石飲食相關(guān)性病因?qū)W模型的制備及評(píng)價(jià)[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2012,25(5)： 555-558.

[4] 盧鋒,張士青,譚桂梗.腎結(jié)晶光鏡觀察評(píng)分法的可靠性研究[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2012,17(6)： 553- 555.

[5] 吳俊標(biāo),周玖瑤,王燕哲，等.五苓散對(duì)EG-NH4Cl誘導(dǎo)大鼠腎結(jié)石的影響[J].中藥藥理與臨床,2013,29(4)： 8-11.

[6] Khan A, Khan SR, Gilani AH. Studies on the in vitro and in vivo antiurolithic activity of Holarrhena antidy-senterica[J]. Urol Res, 2012,40(6)： 671-681.

[7] 伍喜媛,秦莉,陳宇璽.Image-Pro Plus在眼科角膜上皮愈合面積測量中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)教育技術(shù),2010,24(2)： 183-185.

[8] 王青,曾衍鈞,歐陽駿，等.基于IPP開發(fā)平臺(tái)的病理專項(xiàng)檢測系統(tǒng)的研制[J].中國圖象圖形學(xué)報(bào),2002,7(10)： 1099-1103.

[9] 李春波,何燕玲,張明園.一致性檢驗(yàn)方法的合理應(yīng)用[J].上海精神醫(yī)學(xué),2000,12(4)： 228-232.

[10] 夏邦世,吳金華.Kappa一致性檢驗(yàn)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,2(1)： 83-84.

[11] 楊奇明,林堅(jiān).組內(nèi)相關(guān)系數(shù)： 定義辨析、估計(jì)方法與實(shí)際應(yīng)用[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)： 理學(xué)版,2013,40(5)： 509-515.

Evaluation of calcium oxalate crystallization with software Image-Pro Plus

CAOQiu-shi1,YANGLiu1,BAYuan-ming2,LUOJun-hua1,3,CHENWei-dong1,4

(1. Clinical Institute, Hubei Traditional Chinese Medicine University, Wuhan 430061, Hubei Province, China; 2. Dept. ofNephrology, Hubei Traditional Chinese Medicine Hospital, Wuhan 430061, Hubei Province, China; 3. Dept. of Geriatrics, WuhanGeneral Hospital of PLA Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China; 4. Dept. of Nephrology, WuhanMunicipal Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Wuhan 430022, Hubei Province, China)

Objective To evaluate the feasibility, reliability and stability of Image-Pro Plus (IPP) image analysis software in assessment of calcium oxalate crystallization. Methods Two researchers assessed independently the same batch of calcium oxalate crystallization in histopathological sections with manual method and IPP software, and the consistency of scores was analyzed. A week later, one of researchers assessed the same sections with manual method and IPP software again, and the consistency of two scores was also analyzed. Results The consistency of scores between two researchers or between two assessments by one researcher with IPP software was higher than that with manual method. Conclusion The IPP analysis software in assessment of calcium oxalate crystallization is feasible, reliability and stability, and can be applied for evaluation of urinary calculi clinically.

Image-Pro Plus; calcium oxalate crystallization; score

10.16118/j.1008-0392.2015.01.008

2014-08-12

湖北省衛(wèi)生廳科研重點(diǎn)項(xiàng)目(JX6A09)

曹秋實(shí)(1986—)，女，博士研究生.E-mail： 530707198@qq.com

巴元明.E-mail： 1723426138@qq.com

R 91

A

1008-0392(2015)01-0033-04