胡光輝， 賴 鵬， 劉 歡， 羅 明， 張海民， 許云飛

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200072)

?

·基礎(chǔ)研究·

Dickkopf-4激活Wnt/PCP通路促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的增殖及侵襲

胡光輝， 賴 鵬， 劉 歡， 羅 明， 張海民， 許云飛

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200072)

目的 研究Dickkopf-4(DKK4)在腎透明細(xì)胞癌(clear cell Renal cell carcinoma， ccRCC)組織中的表達(dá)及其與ccRCC生物學(xué)行為、臨床分期分級和預(yù)后之間的的相關(guān)性。方法 采用RT-PCR、免疫組織化學(xué)及Western印跡法比較42例腎癌和癌旁正常組織中DKK4的表達(dá)水平，觀察其表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、分級之間的關(guān)系；使用pCMV6-DKK4表達(dá)載體轉(zhuǎn)染786-O和A498人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞，檢測、觀察轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞的增殖活性、侵襲力及細(xì)胞凋亡水平，檢測Wnt/β-Catenin(β-Catenin、Cyclin D1)及Wnt/Planar Cell Polarity信號通路(JNK、Rac1)蛋白表達(dá)。結(jié)果 28例(66.7%)腎癌組織中，DKK4的表達(dá)明顯高于正常組織，其表達(dá)水平與腫瘤病理分級分期和臨床特征之間無明顯相關(guān)(P>0.05)；過表達(dá)DKK4的腎癌細(xì)胞株的增殖活性及侵襲力明顯增強(qiáng)；細(xì)胞內(nèi)Wnt經(jīng)典通路蛋白β-Catenin表達(dá)下調(diào)而Cyclin D1表達(dá)上調(diào)；Wnt/PCP通路下游蛋白JNK、Rac1表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 Wnt/β-Catenin通路抑制劑DKK4通過激活Wnt/PCP非經(jīng)典通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)腎癌細(xì)胞侵襲力。

DKK4； 腎腫瘤； 增殖活性； 侵襲力； Wnt/PCP

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma， RCC)是常見的腎實(shí)質(zhì)惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的3%[1]。腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma， ccRCC)是腎癌最常見的亞型，預(yù)后較差。Wnt蛋白參與的信號通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、再生及自我更新中有著極其重要的作用[2]，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切[3-5]。Dickkopf(DKK)家族蛋白是Wnt信號通路拮抗劑，其家族有4個成員(DKK1～4)，DKK1、DKK4對Wnt/β-catenin通路只起阻斷作用；DKK2對Wnt/β-catenin通路既可抑制亦可激活；DKK3對該通路不起作用[6]。DKK4與ccRCC發(fā)生的相關(guān)研究報道卻很少。本實(shí)驗(yàn)通過研究ccRCC組織DKK4的表達(dá)情況及其與臨床病理特征之間的相關(guān)性，探討DKK4對ccRCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取從2001至2011年在同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院手術(shù)切除并均經(jīng)病理確診的42例ccRCC組織標(biāo)本，同時取距腫瘤邊緣3cm以上的癌旁組織42例。其中男性23名，女性19名；平均年齡(59±7.8)歲。T1期11例，T2期15例，T3期7例，T4期9例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性(pN0)34例，陽性(pN1～2)8例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陰性32例，陽性10例。所有患者均未接受放射治療、化學(xué)治療或者免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 786-O和A-498 ccRCC細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基接種于50ml培養(yǎng)瓶，在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時所用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好。

1.2.2 DKK4載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 構(gòu)建包含有人類全長DKK4的DNA片段的質(zhì)粒，用pCMV6-DKK4表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人ccRCC 786-O和A-498細(xì)胞株(FuGENE HD法)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，以未轉(zhuǎn)染DKK4的786-O和A498細(xì)胞株作為對照。選擇在786-O細(xì)胞株中DKK4表達(dá)水平最高的兩份，穩(wěn)定克隆細(xì)胞株(Ⅰ和Ⅱ)，用于后續(xù)研究。

1.2.3 細(xì)胞增殖活性檢測 培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)DKK4后的786-O、A-498細(xì)胞株1周，采用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性。傳代后細(xì)胞培養(yǎng)48、72、96h，向96孔培養(yǎng)板每孔加入10μl CCK8(上海和元生物技術(shù)有限公司)。3～4h后，用酶標(biāo)儀檢測波長450nm處吸光度值(D450)。

1.2.4 細(xì)胞侵襲力檢測 Matrigel膠包被Transwell小室底膜。無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，密度2×105/ml，取200μl加入上室，下室為含10%血清的培養(yǎng)液500μl，37℃溫箱孵育12～18h。用棉簽擦掉小室內(nèi)細(xì)胞，予95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，洗凈風(fēng)干，在Leica熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照。33%冰醋酸洗脫結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀檢測波長490nm處吸光度值(D490)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡水平 收集細(xì)胞，消化，離心后，PBS清洗2次，加入Binding Buffer 100 μl和FITC標(biāo)記的Annexin-V(20 μg/ml)5 μl，室溫避光15～20 min，再加入PI(50 μg/ml)5 μl，避光反應(yīng)5min后，加入400 μl Binding Buffer。上機(jī)分析。

1.2.6 RT-PCR 使用TRIzol提取組織和細(xì)胞的總RNA，鑒定RNA純度，Prime Script RT Master Mix (TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)體系： 2×PCR premix 10μl，Primers 0.8μl，cDNA 1μl；反應(yīng)條件： 95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 31s，讀板，共40個循環(huán)；融解曲線分析。每個樣設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.7 Western印跡法 Proteo JETTM細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，敷一抗(anti-DKK4、anti-β-catenin、anti-Cyclin D1、anti-JNK、anti-Rac1(1∶1000)；anti-GAPDH、anti-β-actin、anti-Lamin B(1∶2000))，4℃過夜，敷二抗(1∶2000)室溫反應(yīng)，洗滌，顯色，顯影，掃描。選取Lamin B組織標(biāo)本細(xì)胞核內(nèi)參蛋白，β-actin作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參蛋白，GAPDH作為體外細(xì)胞內(nèi)參蛋白。

1.2.8 免疫組織化學(xué) 取已制好的石蠟切片，脫蠟、水化，修復(fù)抗原，3%H2O2溶液中孵育滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；封閉，敷一抗anti-DKK4(1∶250)4℃過夜；室溫孵育二抗(1∶400)1h，滴加鏈酶親和素-過氧化物酶，室溫孵育30min；加DAB顯色，蘇木精復(fù)染；常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢。選取200、400倍視野下拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Image Pro Plus軟件分析免疫組化結(jié)果，Graphpad Prism 5.0繪圖，t檢驗(yàn)分析組間年齡差異，χ2檢驗(yàn)分析性別差異，Spearman相關(guān)性分析DKK4表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)、生存的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DKK4在ccRCC和癌旁正常組織中的表達(dá)

28例ccRCC組織中，DKK4基因表達(dá)水平相對于癌旁正常組織顯著上調(diào)(圖1)，納入DKK4高表達(dá)組。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示： DKK4在腎正常組織中細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均有染色，主要集中在細(xì)胞核(圖2)。而在腫瘤組織中，DKK4同樣在胞核、胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)，但細(xì)胞核內(nèi)染色明顯較細(xì)胞質(zhì)以及腎正常細(xì)胞核內(nèi)染色深(圖3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.160，P=0.0337<0.05)。DKK4表達(dá)水平與患者性別、腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的相關(guān)性見表1。

圖1 DKK4 mRNA在腎透明細(xì)胞癌組織中的相對表達(dá)水平Fig.1 DKK4 mRNA expression level in clear cell renal carcinoma by RT-PCR*P<0.0001

圖2 正常腎臟組織中DKK4蛋白表達(dá)分析Fig.2 DKK4 protein expression in normal kidney tissues(A×200 and B×400)

圖3 腎透明細(xì)胞癌中DKK4蛋白表達(dá)分析Fig.3 DKK4 protein expression in ccRCC tissues(A×200 and B×400)

參數(shù)表達(dá)上調(diào)(n=28)表達(dá)下調(diào)(n=14)χ2/rP值年齡/歲61±5.857±8.1t=1.8420.073性別 男性(n=23)158 女性(n=19)1360.0480.545T分期 T1(n=11)65 T2(n=15)105 T3(n=7)52 T4(n=9)720.1740.27淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性(n=34)2212 陽性(n=8)62-0.0860.589遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 陰性(n=32)2111 陽性(n=10)73-0.0400.804總體生存 存活(n=34)2212 死亡(n=8)620.0860.589腫瘤復(fù)發(fā) 未復(fù)發(fā)(n=31)2011 復(fù)發(fā)(n=11)83-0.0770.63

2.2 轉(zhuǎn)染DKK4后ccRCC細(xì)胞株活力、侵襲力及腫瘤細(xì)胞凋亡水平檢測

qRT-PCR顯示，786-OⅠ、786-OⅡ和A498細(xì)胞株中DKK4成功過表達(dá)(均P<0.05)，見圖4。細(xì)胞增殖活性及侵襲力檢測顯示，786-OⅠ 、786-OⅡ和A498腫瘤細(xì)胞的增殖活性及侵襲力顯著高于對照組(均P<0.05)，見圖5～6。與對照組相比，兩類腫瘤細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖7。因此，過表達(dá)DKK4促進(jìn)ccRCC細(xì)胞增殖和侵襲。

圖4 DKK4在轉(zhuǎn)染后腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.4 Expression of DKK4 in transfected 786-O and A498 cells

圖5 轉(zhuǎn)染后的腎癌細(xì)胞增殖活性Fig.5 Cell viability in transfected 786-O and A498 cells

圖6 轉(zhuǎn)染后的腎癌細(xì)胞侵襲力Fig.6 Cell invasion in transfected 786-O and A498 cells

2.3 下游靶蛋白表達(dá)水平檢測

腫瘤組織和正常組織細(xì)胞質(zhì)中，β-catenin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.825，P=0.459>0.05)，而腫瘤細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)高于正常組織(t=2.833，P=0.047<0.05)，ccRCC細(xì)胞核內(nèi)β-catenin略高于細(xì)胞質(zhì)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.812，P=0.144>0.05)，見圖8。Western印跡法果顯示，穩(wěn)轉(zhuǎn)組DKK4蛋白表達(dá)水平顯著升高(t=38.49，P<0.0001)，β-catenin表達(dá)水平下調(diào)(t=4.174，P=0.014<0.05)，Cylin D1表達(dá)上調(diào)(t=3.603，P=0.0227<0.05)，Rac1表達(dá)上調(diào)(t=3.659，P=0.022<0.05)，JNK表達(dá)上調(diào)(t=2.799，P=0.048<0.05)，見圖9。

圖7 腎癌細(xì)胞株中的腫瘤細(xì)胞凋亡水平Fig.7 Cell apoptosis in transfected 786-O and A498 cells

圖8 腎透明細(xì)胞癌組織的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白表達(dá)水平Fig.8 Expression level of β-catenin cell plasma,cell nucleus in ccRCC tissues

圖9 轉(zhuǎn)染后的腎癌細(xì)胞株中下游蛋白表達(dá)水平Fig.9 Expression level of down-stream target protein in transfected 786-O and A498 cells

3 討 論

1999年，研究[7]發(fā)現(xiàn)DKK4能負(fù)性調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，但其在ccRCC的發(fā)生、發(fā)展過程中的研究甚少。作為Wnt/β-catenin通路的上游阻斷劑，在DKK蛋白家族中，DKK4與DKK1相似，都與LRP5/6和Krms結(jié)合[8]。但是他們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用卻不相同。研究發(fā)現(xiàn)DKK家族的作用具有細(xì)胞特異性，在一些腫瘤中具有抑癌基因的作用，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長[9-11]，而在部分腫瘤中卻有促癌作用[12]。DKK1、DKK2、DKK3在腎癌中的中被甲基化修飾表達(dá)失活[13-14]，DKK4表達(dá)上調(diào)[15]，其中DKK1、DKK2表達(dá)與腎癌分級和病理分期相關(guān)。DKK1、DKK2、DKK3對腎癌細(xì)胞功能影響的作用機(jī)制不盡相同。DKK1主要通過調(diào)控Caspase-3、p53、p21、puma調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用[14]，而DKK2則通過調(diào)控Bcl-2和Cyclin D1調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化；DKK3則通過調(diào)控JNK信號通路而非Wnt/β-catenin通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。DKK4在ccRCC中DKK4表達(dá)上調(diào)，在細(xì)胞核中的表達(dá)增高。同樣，β-catenin在腎癌細(xì)胞核內(nèi)積聚，而β-catenin已經(jīng)被明確是Wnt通路的重要轉(zhuǎn)錄因子。DKK4具有類似的亞細(xì)胞分布。研究[16]顯示，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，DKK4的表達(dá)與β-catenin下游轉(zhuǎn)錄基因纖維母細(xì)胞生長因子-20(fibroblast growth factor-20)表達(dá)水平和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin積聚水平呈正相關(guān)[16]。Baehs等[17]報道，DKK4存在TCF的結(jié)合位點(diǎn)，沉默DKK4后使β-catenin/Tcf-4活動增強(qiáng)，過表達(dá)DKK4能有效抑制β-catenin/Tcf-4活動，并且抑制腫瘤細(xì)胞的生長和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化。熒光素酶報告基因分析[18]顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染LEF-1和β-catenin后，能誘導(dǎo)DKK4表達(dá)上調(diào)。因此，DKK4可能是Wnt/β-catenin通路下游靶基因，可能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控ccRCC的發(fā)生、發(fā)展。研究[19]顯示，DKK3也可能在肝癌中作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮促癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在體外過表達(dá)DKK4后，細(xì)胞內(nèi)總β-catenin蛋白表達(dá)量下調(diào)，其下游蛋白Cyclin D1的表達(dá)上調(diào)。作為Wnt通路下游蛋白，β-catenin可以激活Cyclin D1，但同時Cyclin D1的表達(dá)也受JNK調(diào)控。在人胰腺癌和裸鼠抑制瘤模型中抑制JNK表達(dá)后，能顯著下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，并且JNK激活Cyclin D1能調(diào)控肝細(xì)胞再生。本研究中，過表達(dá)DKK4抑制Wnt/β-catenin信號下游轉(zhuǎn)錄活動，卻使Cylin D1表達(dá)上調(diào)，這可能與DKK4激活了JNK有關(guān)。Wnt通路還包含Wnt/Ca2+非經(jīng)典信號通路，DKK4是否對此信號通路有作用，將在今后的研究繼續(xù)探討。

綜上所述，DKK4作為Wnt/β-catenin經(jīng)典通路抑制劑，DKK4同DKK1、DKK2、DKK3在腎透明細(xì)胞癌中發(fā)揮著完全不同的作用，DKK4雖然抑制Wnt/β-catenin信號，但通過激活Wnt/PCP信號通路并且作為轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮促癌作用。

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Dickkopf- 4 activates Wnt/PCP pathway to promote the proliferation and invasion of renal cell carcinoma

HUGuang-hui,LAIPeng,LIUHuan,LUOMing,ZHANGHai-min,XUYun-fei

(Department of Urology, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the expression level of DKK4 in clear cell renal cell carcinoma and its association with tumourigenesis and progression of ccRCC. Methods The expression level of DKK4 in 42 cases of ccRCC compared with matched adjacent normal kidney tissues were detected by RT-PCR, immunohistochemistry and Western blot, and its correlation to the clinical features were explored. Plasmids that contained the human full-length combinational DNA fragment of DKK4 were used to transfected 786-O and A498 cells. Cell viability, cell invasion and apoptosis of stable transfected DKK4 cells were tested. Downstream target protein of Wnt/β-Catenin pathway(β-Catenin, Cyclin D1)and Wnt/PCP pathway(JNK,Rac1)were detected. Results Of the 42 specimens, 28(66.7%)has clearly high expression level of DKK4 mRNA compared to matched adjacent normal kidney tissues. No correlation was found between the overexpressed DKK4 and tumor clinical characters (P>0.05). β-Catenin was downregulated in stable transfected cells but Cyclin D1, JNK and Rac1 up-regulated. Conclusion DKK4 as Wnt/β-Catenin pathway inhibitor may promote the proliferation and invasion of ccRCC.

DKK4; clear cell renal cell carcinoma; cell viability; cell invasion; apoptosis; Wnt/PCP

10.16118/j.1008-0392.2015.01.005

2014-04-13

上海市科委項目(12ZR1423200)

胡光輝(1990—)，碩士研究生. E-mail： brianhu13@live.com

許云飛.E-mail： xuyunfeibb@sina.com

R 737.11

A

1008-0392(2015)01-0018-06