楊興國

近年來食品安全得到了世界各國的普遍關(guān)注。每年向衛(wèi)生部上報(bào)的食物中毒人數(shù)逐年遞增，且大部分是由食源性致病菌所引起。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物引起的。由此可見，食源性疾病與食品污染問題已成為世界范圍內(nèi)舉足輕重的公共衛(wèi)生問題。同時，GB 29921-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》于2014年7月1日實(shí)施，對食品中致病菌的規(guī)定更加嚴(yán)格。所以建立有效的食源性致病菌檢測體系，快速并且準(zhǔn)確地完成對食品中致病菌的檢測已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，除了傳統(tǒng)檢測方法外，在食源性致病菌檢測領(lǐng)域出現(xiàn)了許多比傳統(tǒng)方法更快捷、敏感性更好的新技術(shù)，如免疫學(xué)檢測技術(shù)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)等。本文對目前國內(nèi)外食源性致病菌的檢測方法進(jìn)行歸納和綜述，并對不同方法進(jìn)行闡述和分析。

免疫學(xué)方法

檢測食品中致病菌的免疫學(xué)方法主要有免疫擴(kuò)散法、反向間接凝血試驗(yàn)（即HA）、反向被動乳膠凝集試驗(yàn)（RPLA）、放射免疫法（RIA）、免疫熒光技術(shù)（IFT）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

最初應(yīng)用的免疫學(xué)方法為免疫擴(kuò)散法，它主要分為單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，但這兩種方法的檢出靈敏度較低，檢測的食品標(biāo)本需要濃縮，操作量大、工作繁瑣，因而未能推廣。RIA的應(yīng)用將同位素測定的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性有效地結(jié)合在一起，使得其檢測的靈敏度和特異性均有所提高而且具有簡單、快速的特點(diǎn)。RIA測定食品標(biāo)本不需要濃縮，1～2d內(nèi)可出結(jié)果，檢測各種食品中的金黃色葡萄球菌的靈敏度為1～10ng/g，但該方法存在放射性污染和需要專門的防護(hù)設(shè)備、檢測儀器等問題，也不易推廣。

免疫熒光技術(shù)（IFT）是在將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的熒光反應(yīng)，可用來對葡萄球菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌和單核增生李斯特氏菌等進(jìn)行快速檢測。此方法的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。但存在一些不足尚未完全解決，如非特異性染色問題，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序比較復(fù)雜。

ELISA方法是一種敏感、快速、簡單的方法，應(yīng)用較廣。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的基本原理是將抗原或抗體預(yù)先吸附于固相載體表面，再加入受檢樣品和酶標(biāo)抗體，進(jìn)行免疫酶染色，最后經(jīng)固相載體上的酶催化產(chǎn)生顏色變化，從而判斷受檢樣品是否含有目的抗原。同時通過分析有色產(chǎn)物量可以確定樣品中待測物質(zhì)的含量。國內(nèi)外學(xué)者采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對不同的細(xì)菌進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ELISA法對多種食源性致病菌的靈敏度和特異性較好。但ELISA對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分，且對結(jié)構(gòu)類似的化合物有交叉反應(yīng)。

基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是上個世紀(jì)末誕生的一項(xiàng)新型生物技術(shù)。它是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特異微生物。其檢測致病菌原理為：選擇細(xì)菌的共有基因作為靶基因，用一對通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，再利用芯片上的探針檢測不同細(xì)菌在該共有基因上的獨(dú)特堿基，從而區(qū)分不同的細(xì)菌，此法還可以通過向寡核苷酸探針陣列中添加相應(yīng)的探針來逐步擴(kuò)大基因芯片的檢測范圍，并通過增加和調(diào)整探針來逐步提高基因芯片的準(zhǔn)確性?；蛐酒夹g(shù)理論上可以在一次實(shí)驗(yàn)中檢出所有潛在的致病菌，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學(xué)指標(biāo)，檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發(fā)展前景。

核酸探針技術(shù)

核酸探針檢測技術(shù)的依據(jù)是核酸雜交，其工作原理是兩條堿基互補(bǔ)的DNA鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下可以按堿基互補(bǔ)配對原則，形成雜交DNA分子。已知每個生物的各種性質(zhì)和特征都是由其所含的遺傳基因所決定，因此，從理論上講，任何一個決定生物體特定生物學(xué)特征的DNA序列都應(yīng)該是獨(dú)特的。通過將微生物的特征基因的一條DNA鏈進(jìn)行標(biāo)記，即可制成DNA探針。標(biāo)記的方法可分為兩種：放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。放射性探針是以同位素為標(biāo)記物，常用的同位素包括32P、3H、35S，通過放射自顯影檢測分析結(jié)果；非放射性探針是以生物素、酶和熒光素等為標(biāo)記物，雜交后通過酶催化底物顯色反應(yīng)、熒光顯微鏡或熒光儀檢測雜交結(jié)果。用大腸桿菌編碼葡萄糖醛酸酶的uidA基因設(shè)計(jì)探針，用以檢測食品中的總大腸桿菌。

光學(xué)生物傳感技術(shù)

光學(xué)生物傳感器源于傳統(tǒng)的物理傳感器，它將反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為光信號，其最大的優(yōu)點(diǎn)是抗外界干擾能力強(qiáng)。光學(xué)生物傳感器的檢測模式有吸收、反射、化學(xué)發(fā)光、熒光和磷光等，在致病菌檢測中最有應(yīng)用前景的技術(shù)包括表面等離子共振技術(shù)等。表面等離子共振技術(shù)是一種基于反射光譜的非標(biāo)記檢測技術(shù)。它將已知生物分子固化在幾十納米厚的金屬膜表面，加入能夠與之結(jié)合的目標(biāo)生物分子，由此引發(fā)的光學(xué)信號隨機(jī)被表面等離子共振傳感器轉(zhuǎn)化為電信號進(jìn)行檢測分析。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是在體外合適條件下，以DNA為模板，以一對人工合成的寡核苷酸為引物在耐熱DNA聚合酶作用下特異性擴(kuò)增目的DNA片段的技術(shù)。近年來應(yīng)用PCR技術(shù)檢測食源性致病菌的技術(shù)有很多，如常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時熒光定量PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、不對稱PCR、免疫PCR、套式PCR和電化學(xué)發(fā)光PCR等。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種DNA擴(kuò)增技術(shù)。多重PCR在同一反應(yīng)體系中同時加入多對引物，擴(kuò)增多條目的DNA片段，所以可以同時檢測多個目標(biāo)菌。相對于傳統(tǒng)檢測方法，多重PCR檢測技術(shù)可以極大地縮短檢測時間，且操作簡單、特異性和敏感度較高。因此采用多重PCR方法檢測多種細(xì)菌一直是細(xì)菌快速檢測的研究熱點(diǎn)。但是多重PCR技術(shù)在實(shí)際的檢驗(yàn)工作中還存在一些問題：如提取得到的DNA片段可能不完整，多組引物之間的相互干擾，高濃度模板對低濃度模板產(chǎn)生競爭性抑制以及樣品中可能含有PCR抑制物質(zhì)等。

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出。實(shí)時熒光PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光分子，通過熒光信號的強(qiáng)弱來實(shí)時反應(yīng)模板的擴(kuò)增量，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時熒光PCR技術(shù)采用全密閉管檢測，不僅實(shí)現(xiàn)對DNA模板定量，還能避免電泳帶來的誤差和污染，具有重復(fù)性好、自動化程度高、實(shí)時性強(qiáng)和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。實(shí)時定量PCR類型主要有探針類和非探針類兩種。探針類是利用與靶序列特異雜交探針指示擴(kuò)增產(chǎn)物增加，特異性好；而非探針類是利用染料或特殊設(shè)計(jì)引物指示擴(kuò)增產(chǎn)物增加，特異性不強(qiáng)，但簡便易行。目前在國內(nèi)外實(shí)時熒光定量PCR廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究、病原體檢測等領(lǐng)域。

食品安全問題關(guān)系到國計(jì)民生，隨著經(jīng)濟(jì)社會的不斷發(fā)展，必然會對食源性致病菌的檢測提出越來越多的要求。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、分離、鑒定與檢測的技術(shù)耗時長且檢出敏感性差。但使用傳統(tǒng)檢測方法可獲得供后續(xù)研究的致病菌菌落，所以該方法仍是食源性致病菌檢測的最基本檢驗(yàn)方法。

對于食品中的致病菌檢測來說，依靠單一的手段已不能滿足現(xiàn)階段的檢測要求。多種技術(shù)的聯(lián)用可大大提高檢測的靈敏度，并減少檢測時間。隨著微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，各種多功能微生物檢測系統(tǒng)的研發(fā)逐步成為熱點(diǎn)。3M分子檢測系統(tǒng)就將環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）和生物熒光實(shí)時檢測技術(shù)（BART）結(jié)合在一起，可實(shí)現(xiàn)在分子層面上對食源性致病菌準(zhǔn)確、高效的檢測。隨著人們對食品微生物認(rèn)識的逐步深入，相信會有越來越多的食源性致病菌分析方法和檢測技術(shù)應(yīng)用到實(shí)際生活中。