王寧，趙燕燕,Δ，陶文杰，劉麗麗，劉萬卉,3

(1.煙臺大學 藥學院，山東 煙臺 264005；2.山東博安生物技術(shù)有限公司 抗體技術(shù)研究部，山東 煙臺 264005；3.綠葉制藥集團有限公司 長效和靶向制劑國家重點實驗室，山東 煙臺 264005)

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陶瓷羥基磷灰石去除單抗聚集體的工藝研究

王寧1，趙燕燕1,2Δ，陶文杰2，劉麗麗2，劉萬卉1,3

(1.煙臺大學 藥學院，山東 煙臺 264005；2.山東博安生物技術(shù)有限公司 抗體技術(shù)研究部，山東 煙臺 264005；3.綠葉制藥集團有限公司 長效和靶向制劑國家重點實驗室，山東 煙臺 264005)

目的 研究陶瓷羥基磷灰石(ceramic hydroxyapatite，CHT) I型和II型對2種單克隆抗體(monoclonal Ab，mAb)1和2聚集體的去除工藝。方法 層析儀為AKTA AVANT 150，層析柱為Tricon 10/50，先進行CHT I、CHT II 2種填料的動態(tài)載樣量研究，然后選取合適的載量進行分離純化研究。上樣條件為5 mmol/L磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，pH 6.5，上樣，然后用10 mmol/L NaH2PO4，pH 6.5和10 mmol/L NaH2PO4，2 mol/L NaCl，pH 6.5梯度洗脫來分離單體和聚集體。用分子尺寸排阻高效液相色譜(SEC-HPLC)測定上樣蛋白溶液和洗脫峰單體及聚集體的含量。使用20 cm高的XK 16/40的層析柱進行工藝放大研究。結(jié)果 mAb 1在CHT I型的載量為40 mg/mL，去除后單體含量為98.6%，工藝收率為92.5%；mAb 2在CHT I型的載量為45 mg/mL，去除后單體含量為98.8%，工藝收率為91.5%；mAb 1在CHT II型載量為16 mg/mL，去除后單體含量為99.8%，工藝收率為91.8%；mAb 2在CHT II型載量為20 mg/mL，去除后單體含量為99.9%，工藝回收率為92.2%。結(jié)論 2種類型的陶瓷羥基磷灰石填料在聚集體含量高于10%的情況下，都有很好的去除能力，去除結(jié)果符合法規(guī)要求。該方法操作簡單，能夠很順利的進行工藝放大，滿足中試和生產(chǎn)需求。

陶瓷羥基磷灰石；單克隆抗體；純化工藝；聚集體

近年來，單克隆抗體(簡稱單抗)已成為世界生物工程制藥業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。在單抗的純化過程中，如果pH<3，單抗會發(fā)生不可逆聚集；鹽濃度過高會增加疏水聚集；堿性單抗在多價陰離子緩沖液中易形成穩(wěn)定的離子復合物，導致單抗之間的聚合；這些過程都可能產(chǎn)生聚集體。單抗中的聚集體是工藝過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，聚集體過高會促進形成中和單抗、引起血栓等[2-3]。在工業(yè)化生產(chǎn)中，為保證終產(chǎn)品的均一性和高比活，簡單有效的去除單抗聚集體的方法對提高單抗藥物的質(zhì)量至關(guān)重要[4-6]。

聚集體的去除可以通過陽離子交換和疏水層析進行去除，研究發(fā)現(xiàn)，當聚集體含量超過10%的時候，陽離子交換樹脂和疏水層析很難達到理想的效果，而羥基磷灰石層析方法能夠去除單抗中含量較高的聚集體[7-10]。

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的分子式為[Ca5(PO4)3OH]2[11]，包括帶正電荷的鈣離子和帶負電荷的磷酸根離子，其與單抗主要有兩種作用機制，磷酸根易與單抗中的堿性基團作用，通過增加中性鹽離子例如氯化鈉會破壞這種作用力，結(jié)合的單抗從柱子上解離下來；鈣離子與單抗中的酸性基團以金屬螯合方式結(jié)合，主要通過磷酸鹽將吸附的單抗洗脫下來[12]。

本文采用伯樂公司生產(chǎn)的陶瓷羥基磷灰石(ceramic hydroxyapatite，CHT)，對比研究CHT I和CHT II 2種填料對2種單抗(mAb1和mAb2)中聚集體的去除效果。層析條件是伯樂公司提供的單抗聚集體去除的普遍適用條件，經(jīng)過簡單優(yōu)化[13-14]。單體和聚集體含量測定采用SEC-HPLC方法[15-18]。

1 材料與方法

1.1 單抗 單抗mAb 1和mAb 2，聚集體含量分別為14.5%和12.8%。2種單抗是細胞培養(yǎng)液經(jīng)過親和層析純化后的樣品，由山東博安生物技術(shù)有限公司抗體技術(shù)研發(fā)部提供。

1.2 儀器 Cedex Bio生物過程分析儀(Roche公司)；HiprepTM26/10 Desalting脫鹽柱(GE Healthcare公司)；TSK-Gel G30000SWxl 凝膠色譜柱7.8 mm×300 mm(東曹公司)；生物安全柜(Heraeus公司)；AKTA AVANT 150(GE Healthcare公司)。

1.3 填料 CHTTMceramic hydroxyapatite，Type I，40 μm；CHTTMceramic hydroxyapatite，Type II， 40 μm(Bio-Rad公司)。

1.4 試劑 氫氧化鈉(天津永大化學試劑有限公司)；氯化鈉、磷酸二氫鈉(天津博迪化工有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 樣品處理:5 mmol/L NaH2PO4pH 6.5緩沖液平衡HiprepTM26/10 Desalting柱，使用同一緩沖液洗脫，然后依次用0.2 mol/LNaOH、平衡緩沖液清洗脫鹽柱后保存在20%乙醇里。流速4 mL/min。接收洗脫峰，在生物安全柜中使用微孔濾膜過濾后作為上樣蛋白。

1.5.2 CHT I、CHT II的單抗動態(tài)載量:用2種填料裝柱，使用量均為1 mL，取過濾后的蛋白作為測試樣品，用緩沖液A(10 mmol/L NaH2PO4pH 6.5)平衡好離子交換柱，CHT I按照載量為30、40、45、50、55 mg/mL上樣；CHT II按照載量為10、15、20、25、30 mg/mL上樣，分析流穿組分。

1.5.3 CHT I去除2種單抗中的聚集體:取過濾后的蛋白，使用Tricon10/50 (CV4.9 mL) CHT I離子交換柱，緩沖液A為平衡緩沖液，緩沖液A和緩沖液B(10 mmol/L NaH2PO4，2 mol/LNaCl pH 6.5)梯度洗脫(0～50%，40 CV)，收集洗脫峰，然后使用緩沖液C(500 mmol/L NaH2PO4pH 6.5)沖洗柱子上未洗脫下來的成分，收集再生峰[19-20]。流速1 mL/min。檢測洗脫峰聚集體含量，計算回收率。

回收率(%)=純化后單體重量(mg)/純化前單體重量(mg)×100%

1.5.4 CHT II去除2種單抗中的聚集體：取過濾后的蛋白，使用Tricon10/50(CV4.9 mL)CHT II離子交換柱，緩沖液A為平衡緩沖液，緩沖液A和緩沖液B梯度洗脫(20%～50%，30 CV)，收集洗脫峰，然后使用緩沖液C沖洗柱子上未洗脫下來的成分，收集再生峰[19-20]。流速1 mL/min。檢測洗脫峰聚集體含量，計算回收率。

1.5.5 層析柱放大去除2種單抗的聚集體：按照1.5.2和1.5.3方法，使用2種填料分別裝填20 cm高XK16/40層析柱，進行放大，收集洗脫峰和再生峰。檢測洗脫峰聚集體含量，計算回收率。

1.5.6 蛋白濃度的測定：采用紫外分光光度計在280 nm和320 nm處測定吸光度進行定量，用超純水在280 nm和320 nm空白校正，分別測定樣品在280 nm和320 nm處的吸收值。

公式：A=(A280-A320)樣品-(A280-A320)空白

A=ECL；E：摩爾吸光系數(shù)；C：樣品濃度；L：光程1 cm

1.5.7 SEC-HPLC檢測聚集體含量：用0.35 mol/L磷酸鈉和0.35 mol/L氯化鈉混合溶液，pH 7.2作為流動相，樣品用流動相稀釋至0.5 mg/mL，微孔濾膜過濾后進樣檢測。流速0.5 mL/min，檢測波長280 nm，進樣量100 μL，拖尾因子應為0.95～1.40，按面積歸一化法計算供試品中單體和多聚體的含量。

1.6 SEC-HPLC方法學驗證

1.6.1 精密度：取供試品連續(xù)進樣6針，進樣分析，記錄色譜圖，計算峰面積。

1.6.2 準確度：以加樣回收率方法計算，制備聚體含量分別為高、中、低的樣品各3份，進樣分析，記錄色譜圖，計算峰面積。

1.6.3 線性方稱：取高分子量物質(zhì)(多聚體含量較高的純化物質(zhì))溶液和單體物質(zhì)(單體含量較高的純化物質(zhì))溶液，按供試品溶液制備項制備。分別連續(xù)進樣6針，按面積歸一化法，分別計算聚體、單體的平均含量。然后以一定比例混合分別配制成聚體含量為0.1%、3.0%、6.4%、9.4%、12.4%、14.2%、16.4%和18.0%的系列溶液，進樣分析，以聚體含量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.6.4 重復性：取供試品配制6份，進樣分析記錄色譜圖，計算峰面積。

1.6.5 中間精密度：操作者1和操作者2，分別取供試品配制6份，進樣分析，記錄色譜圖，計算峰面積。

2 結(jié)果

2.1 CHT I、CHT II填料對2種單抗的動態(tài)載量結(jié)果 使用生物過程分析儀分析流穿組分，結(jié)果表明CHTI的對mAb 1、mAb 2載量分別為40 mg/mL、45 mg/mL，見圖1；CHT II對 mAb 1、 mAb 2載量分別為16 mg/mL、20 mg/mL，見圖2。

圖1 CHT I 動態(tài)結(jié)合載量Fig.1 CHT I dynamic binding capacity

圖2 CHT II 動態(tài)結(jié)合載量Fig.2 CHT II dynamic binding capacity

2.2 CHT I、CHT II填料去除2種單抗中聚集體的效果 使用SEC-HPLC分別檢測2種單抗的洗脫峰聚集體含量，見圖3。結(jié)果表明：CHT I純化 mAb1、 mAb 2的洗脫峰單體含量分別為98.6%、98.8%。，回收率分別為92.5%、91.5%。CHT II純化mAb 1、mAb 2的洗脫峰單體含量分別為99.8%、99.9%，回收率分別為91.8%、92.2%。

圖3 抗體純化前/后的分子排阻色譜結(jié)果A: 抗體1(前) B：抗體2(前) C：抗體1(后) D：抗體2(后)Fig.3 SEC-HPLC chromotagram of mAb before/after purificationA: mAb1 (before) B： mAb2 (before) C： mAb1 (after) D： mAb2 (after )

2.3 SEC-HPLC方法學驗證結(jié)果

2.3.1 精密度試驗結(jié)果：精密度試驗結(jié)果表明RSD值為0.01%，儀器精密度良好。

2.3.2 準確度試驗結(jié)果：準確度試驗結(jié)果表明平均回收率分別為88.6%、87.9%、99%，RSD值分別為0.13%、0.01%、0.46%，證明方法準確度良好。

2.3.3 線性曲線：標準曲線的回歸方程為：Y=3×106X+275853，R2=0.9997，此方法在聚體含量0.1%～18.0%的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 重復性試驗結(jié)果：重復性試驗結(jié)果表明樣品的RSD值為0.2%，符合要求。

2.3.5 中間精密度試驗結(jié)果：不同試驗者批內(nèi)精密度RSD分別為0.14%、0.16%，結(jié)果符合中間精密度要求。

2.4 工藝放大結(jié)果 使用SEC-HPLC檢測2種單抗的洗脫峰中聚集體含量。結(jié)果表明：CHT II去除聚集體的效果要優(yōu)于CHT I，分辨率高，與放大前的結(jié)果基本一致，方法重現(xiàn)性好。CHT I、CHT II放大結(jié)果見表1。

表1 20 cm XK16/40 層析柱分析結(jié)果Tab.1 Results of 20 cm height XK16/40 column

3 討論

本實驗使用CHT I和CHT II 2種類型的陶瓷羥基磷灰石填料去除2種單抗中的聚集體，2種單抗的聚集體含量都高于10%，層析方法經(jīng)過進一步優(yōu)化梯度洗脫條件，獲得純度超過98.5%的單體。

載樣量實驗證明了CHT I載樣量高于CHT II。聚集體含量測定采用SEC-HPLC方法，結(jié)果顯示CHT II純化后單體比例均高于99.8%，聚集體含量均低于0.2%；CHT I單體比例均高于98.5%，聚集體含量均低于1.5%，而且蛋白的回收率均在90%以上，說明CHT II去除單抗聚集體效果優(yōu)于CHT I。使用XK16/40層析柱對工藝進行了放大，結(jié)果顯示方法具有較好的重現(xiàn)性。實驗中，層析柱使用多次后出現(xiàn)反壓大的問題，需要在每次實驗結(jié)束后進行徹底的清洗，否則會影響聚集體的去除效果。

使用CHT I和CHT II 2種填料去除多聚體方法簡單，容易實現(xiàn)工藝放大。單抗結(jié)構(gòu)在序列上有相當高的一致性，可以在本方法的基礎上優(yōu)化用于去除目標單抗中的聚集體，本文為單抗聚集體的去除提供了實驗依據(jù)和有利參考。

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(編校：王冬梅)

Study on the process of ceramic hydroxyapatite for removing monoclonal antibody aggregates

WANG Ning1, ZHAO Yan-yan1,2Δ, TAO Wen-jie2, LIU Li-li2, LIU Wan-hui1,3

(1.School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264005, China; 2.Department of Antibody Technology, BoanBiotech Group Ltd., Yantai 264005, China; 3.State Key Laboratory of Long-acting and Targeting Drug Delivery System, Luye Pharma Group Ltd., Yantai 264005, China)

ObjectiveTo compare the purification process of two types of ceramic hydroxyapatite(CHT I and CHT II)to remove the aggregates from two monoclonal antibodies(mAb 1 and mAb 2).MethodsAll the chromatography runs were performed on AKTA AVANT 150 with Tricon 10/50 column.The dynamic binding capacity(DBC) of two types of CHT was studied firstly, and then purification research was carried out selecting the suitable DBC.The column was equilibrated with 5 mmol/L sodium dihydrogen phosphate pH 6.5, and then was eluted with gradient buffers which were 10 mmol/L sodium dihydrogen phosphate pH 6.5 and 2 mol/L sodium chloride pH 6.5.Aggregate content in loading and elution pool was evaluated by size exclusion chromatography.Scale-up process was carried on 20 cm height chromatography column XK16/40.ResultsDBC of CHT I for mAb 1 was 40 mg/mL and mAb 2 was 45 mg/mL.After purity, monomer content of mAb 1 reached 98.6% and yield was 92.5% and monomer content of mAb 2 reached 98.8% and yield was 91.5% .DBC of CHT II for mAb1 was 16 mg/mL and mAb 2 was 20 mg/mL.After purity, monomer content of mAb 1 reached 99.8% and yield was 91.8% and monomer content of mAb 2 reached 99.9% and yield was 92.2%.ConclusionTwo types of CHT both can remove aggregates effectively from monoclonal antibodies when aggregate content reaches more than 10%, and results conform to the regulations.CHT I has higher dynamic binding capacity than CHT II, and CHT II is superior to CHT I in removing aggregate efficiency.The purification process is simple and can be easily scaled up in pilot and manufacture.Therefore, it meets the requirement pilot and scale production.

ceramic hydroxyapatite; monoclonal antibody; purification process; aggregate

國家863計劃(2012AA02A302 )

王寧，女，碩士在讀，研究方向：生物制藥，E-mail：294316576@qq.com；趙燕燕，通訊作者，女，博士，講師，研究方向：生物制藥，E-mail：zhaoyy@luye.cn。

R367.2

A

1005-1678(2015)05-0177-04