楊艷，吳芹，龔其海，徐世兵，石京山Δ

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，貴州 遵義 563002；3.遵義市湄潭縣人民醫(yī)院，貴州 遵義 564100)

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黔產(chǎn)毛蒟提取物的制備及其化學(xué)成分的定性分析

楊艷1，吳芹2，龔其海2，徐世兵3，石京山2Δ

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，貴州 遵義 563002；3.遵義市湄潭縣人民醫(yī)院，貴州 遵義 564100)

目的 考察黔產(chǎn)毛蒟提取物制備的最佳工藝，定性分析各提取物的化學(xué)成分。方法 采用溶劑回流加熱法進(jìn)行提取。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取次數(shù)、提取時間、料液比和浸泡時間為因素安排L9(34)正交試驗(yàn)，以提取率為指標(biāo)，優(yōu)選黔產(chǎn)毛蒟提取的最佳工藝；經(jīng)D-101大孔吸附樹脂分離，得到黔產(chǎn)毛蒟水洗脫液、醇洗脫液；采用理化分析方法對黔產(chǎn)毛蒟提取物進(jìn)行初步定性分析。結(jié)果 提取最佳工藝為：提取時間為2 h，提取次數(shù)為3次，料液比為1:30，浸泡時間為2 h；經(jīng)過初步定性反應(yīng)確認(rèn)總提取物含有氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、生物堿、甾體或三萜類、黃酮、皂苷、多糖、還原糖及糖苷、香豆素及萜類內(nèi)酯化合物、酚類和鞣質(zhì)成分；水洗脫物含有氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、皂苷、多糖、還原糖及糖苷、香豆素及萜類內(nèi)酯化合物；乙醇洗脫物含有氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、生物堿、甾體或三萜類、黃酮、多糖、還原糖及糖苷、酚類和鞣質(zhì)成分。結(jié)論 黔產(chǎn)毛蒟提取的最佳工藝提取率高、穩(wěn)定可行。

毛蒟; 提取工藝; 定性分析; 正交試驗(yàn)設(shè)計

毛蒟[Piperpuberulum(Benth.) Maxim.]系胡椒科胡椒屬植物,為多年生攀援藤本，全株有濃烈香氣，幼枝纖細(xì)，密被短柔毛。常生長在密林、疏林中、溝邊陰濕處，主要分布于我國的四川、云南，貴州、廣西、廣東等地。毛蒟全株可藥用，具有行氣止痛，祛風(fēng)活血之功效，主治風(fēng)濕性痹痛、風(fēng)寒頭痛、胃脘痛等[1]。毛蒟在貴州民間已用于治療急慢性肝損傷，療效顯著，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)[2]，因此值得研究開發(fā)。根據(jù)文獻(xiàn)記載，胡椒科植物多具有溫中散寒、行氣止痛等功效[3]。毛蒟同屬植物海風(fēng)藤、假蒟等均已見化學(xué)成分[4-6]、藥理活性方面的研究[7]，但毛蒟化學(xué)成分尚不清楚，所以本實(shí)驗(yàn)以質(zhì)量提取率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的提取條件，并對提取物的化成成分進(jìn)行初步分析，旨在為廣泛深入研究、開發(fā)此植物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 50×900 mm玻璃層析柱(上海琪特分析儀器有限公司)、SHHW電熱恒溫三用水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)、DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、MODULYOD-230冷凍干燥機(jī)(Thermoelectron 公司)。

1.2 藥材與試劑 新鮮毛蒟采自于貴州省黔東南州錦屏縣，經(jīng)貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科楊建文副教授鑒定為胡椒科胡椒屬植物毛蒟的變種[Piperpuberulum(Benth.) Maxim.]。其他試劑均為分析純。

1.3 毛蒟提取工藝條件

1.3.1 藥材的處理：新鮮毛蒟(20 g)以純化水適當(dāng)沖洗去除泥土，于40 ℃烘箱中低溫干燥，粉碎成粗粉，密封于璃瓶內(nèi)備用。

1.3.2 毛蒟的提取方法：稱取約10 g毛蒟干燥粗粉放置于圓底燒瓶中，按一定比例加入蒸餾水(料液比)，浸泡合適的時間(浸泡時間)，加熱提取數(shù)小時(提取時間)，加熱結(jié)束后，趁熱真空抽濾，收集濾液。殘?jiān)谜麴s水洗入圓底燒瓶中，再次加熱回流提取，提取數(shù)次(提取次數(shù))后，同樣趁熱真空抽濾，合并濾液。濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑、濃縮，置于冷凍干燥機(jī)干燥得毛蒟總提取物。

1.3.3 提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)：①料液比：分別稱取約10 g毛蒟粗粉末5份，于圓底燒瓶中，加入100、200、300、400、500 mL (料液比為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)蒸餾水，浸泡2 h，固定提取溫度，提取時間2 h的條件下，提取3次，考察料液比對粗提取物的質(zhì)量提取率的影響，每一條件下重復(fù)測定3次，取平均值。②提取次數(shù)：分別稱取約10 g毛蒟粗粉末5份，于圓底燒瓶中，加入“1.3.3”項(xiàng)下①方法得到的質(zhì)量提取率最高的體積比的水，浸泡2 h，固定提取溫度，提取時間2 h的條件下，提取1、2、3、4次，考察提取次數(shù)對粗提取物的質(zhì)量提取率的影響，每一條件下重復(fù)測定3次，取平均值。③提取時間：分別稱取約10 g毛蒟粗粉末5份，于圓底燒瓶中，加入“1.3.3”項(xiàng)下①方法得到的質(zhì)量提取率最高的體積比的水，浸泡2 h，固定提取溫度，提取時間0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h的條件下，按照提取“1.3.3”項(xiàng)下②方法得到的質(zhì)量提取率最高的次數(shù)，考察提取時間對粗提取物的質(zhì)量提取率的影響，每一條件下重復(fù)3次，取平均值。④藥材浸泡時間：分別稱取約10 g毛蒟粗粉末5份，于圓底燒瓶中，加入“1.3.3”項(xiàng)下①方法得到的質(zhì)量最高的體積比的水，浸泡0.5、1、1.5、2、2.5 h，固定提取溫度，提取時間為“1.3.3”項(xiàng)下③質(zhì)量提取率最高的時間，提取“1.3.3”項(xiàng)下②方法得到的質(zhì)量提取率最高的次數(shù)，考察藥材浸泡時間對質(zhì)量提取率的影響，每一條件重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比(A)、浸泡時間(B)、提取次數(shù)(C)、提取時間(D)為考察因素。以質(zhì)量提取率為指標(biāo)，選用L9(34)正交表根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下的方法安排提取實(shí)驗(yàn)。每一水平重復(fù)3次，取其平均值。采用直觀分析方法，根據(jù)極差大小和方差分析確定影響提取因素的主次順序。正交實(shí)驗(yàn)因素水平，見表1。

表1 提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of extraction test

料液比=毛蒟干燥粗粉質(zhì)量︰蒸餾水質(zhì)量

1.3.5 提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證試驗(yàn)：稱取毛蒟粗粉末約10 g各3份，用“1.3.4”優(yōu)選出來的最佳提取工藝參數(shù)照“1.3.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)3次，分別計算質(zhì)量提取率，以此來驗(yàn)證提取工藝的穩(wěn)定性和可行性。

1.3.6 毛蒟總提取物的制備：取毛蒟干燥藥材10.0 kg，粉碎，用1:30體積比的蒸餾水浸泡2 h，冷凝回流3次，每次回流時間為2 h，真空抽濾后合并濾液，減壓濃縮后冷凍干燥，得得毛蒟總提取物(以下簡稱總提物)。

1.3.7 毛蒟總提取物的分離：將毛蒟總提取物進(jìn)行分離，采用D-101大孔樹脂，將其進(jìn)行酸、堿處理，得到大孔樹脂填裝，再將大孔樹脂填裝進(jìn)行醇、水處理，得到待用大孔樹脂；將上一步驟中得到的毛蒟總提取物溶解、離心，得到總提物上清液；將總提物上清液緩慢加入待用大孔樹脂內(nèi)進(jìn)行水洗脫；將水洗脫畢后的水洗液減壓回收溶劑，得到水洗浸膏，再將該水洗浸膏冷凍干燥后，即得到毛蒟水提物；另外，將水洗脫畢的余下物進(jìn)行醇洗脫，將得到的醇洗液減壓回收溶劑，得到醇洗浸膏，將該醇洗浸膏冷凍干燥后，即得到毛蒟醇提物。

1.3.8 總提物、水洗物、醇洗物定性實(shí)驗(yàn)：

① 氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)的定性檢測：

茚三酮(Ninhydrin)實(shí)驗(yàn)：分別取總提液2 mL于試管中，加試劑3～5滴，在沸水浴上加熱5 min，冷卻后有藍(lán)色或藍(lán)紫色出現(xiàn)。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

雙縮脲(Biuret)反應(yīng)：分別取總提液2 mL于試管中，加入試劑，搖動，冷卻時候顯綠色—紫紅色。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

② 生物堿的定性實(shí)驗(yàn)

碘- 碘化鉀(Wagner)實(shí)驗(yàn)：分別取總提液2mL 于試管中，加入試劑，生成棕色沉淀。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

碘化汞鉀(Mayer)實(shí)驗(yàn)：分別取總提液2 mL 于試管中，加入試劑，生成紅棕色沉淀。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

苦味酸試劑：分別取總提液2 mL于試管中，加入試劑，生成棕黃色沉淀。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

③ 甾體或三萜類的定性檢測

Liebrmann-Burchand反應(yīng)：分別取總提液0.5 mL懸浮于1 mL 醋酐中，沿試管壁緩慢滴加1 mL濃硫酸，溶液逐漸呈紫紅色。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

④ 黃酮的定性檢測

鉛鹽反應(yīng)：分別取總提液2 mL于試管中，加入試劑，生成棕黃色沉淀。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

三氯化鋁- 乙醇實(shí)驗(yàn)：分別取總提液2 mL 于試管中，加入試劑，充分振搖，于365 nm 下呈現(xiàn)明顯綠色或黃綠色熒光。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

⑤ 皂苷的定性檢測

泡沫實(shí)驗(yàn)：分別取總提液2 mL 于試管中，充分振搖，產(chǎn)生蜂窩狀泡沫，10 min不消退，加入少量95%乙醇泡沫也無明顯減少。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

⑥ 多糖、還原糖及糖苷的定性檢測

α-萘酚試劑反應(yīng)：分別取總提液2 mL 于試管中，加入5% α-萘酚乙醇溶液3～5滴，充分振搖，再沿試管壁緩慢滴加 0.5 mL濃硫酸，在試液與濃硫酸交界處形成紫色環(huán)。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

費(fèi)林(Fehling)試劑反應(yīng)：分別取總提液2 mL于試管中，加試劑 3～5滴，充分振搖，在沸水浴上加熱5 min，有磚紅色沉淀生成。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

多糖實(shí)驗(yàn)：分別取總提液2 mL 于試管中，分加入1倍量的95% 乙醇，出現(xiàn)絮狀懸浮物或沉淀。以蒸餾水為對照，同法進(jìn)行操作。

⑦ 香豆素及萜類內(nèi)酯化合物的定性檢測

開環(huán)閉環(huán)反應(yīng)：分別取總提液1 mL于試管中，加入 1% 氫氧化鈉溶液2 mL 在沸水浴上加熱3～4 min，再加入2% 鹽酸酸化，放置一段時間液體出現(xiàn)渾濁或沉淀。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

⑧ 酚類和鞣質(zhì)的定性檢測

氯化鈉- 明膠試劑反應(yīng)：分別取總提液各2 mL于試管中，加入試劑，出現(xiàn)白色沉淀。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

三氯化鐵試劑反應(yīng)：分別取總提液2 mL于試管中，滴加2～3滴醋酸酸化，搖勻，再加入試劑，呈藍(lán)或墨綠色。以乙醇液為對照，同法進(jìn)行操作。

表2 定性檢測實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象Tab.2 Phenmenon of qualitative detection experiment

2 結(jié)果

2.1 提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對質(zhì)量提取率的影響：隨著料液比的增加，提取率一直是遞增趨勢，料液比為1:50時提取率達(dá)到最高為22.31%。但是在料液比1:30之后升高趨勢變得緩慢，說明在料液比為1:30時提取很充分。提取溶劑體積太大會給后續(xù)的過濾、濃縮等工作帶來困難，綜合上述因素，因此選擇最佳的料液比在1:30為宜。見圖1。

圖1 料液比對提取率的影響Fig.1 Effect of the ratio of material to liquid on extraction yield

2.1.2 浸泡時間對質(zhì)量提取率的影響：提取率隨著浸泡時間的增加，也逐漸增大，而且一直是遞增趨勢，當(dāng)浸泡時間為2.5 h時提取率達(dá)到最高點(diǎn)，但2.0 h和2.5 h的質(zhì)量提取率相差不大，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率，因此選擇浸泡時間在2.0 h較適宜。見圖2。

圖2 浸泡時間對提取率的影響Fig.2 Effect of steeping time on extraction yield

2.1.3 提取時間對質(zhì)量提取率的影響：提取率在2 h時達(dá)到最高點(diǎn)，在此之后提取率下降，說明藥材中某些有效成分可能因?yàn)樘崛r間的延長而發(fā)生了分解，綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)的效率等問題，因此選擇最佳的提取時間在2.0 h為宜。見圖3。

圖3 提取時間對提取率的影響Fig.3 Effect of extract time on extraction yield

2.1.4 提取次數(shù)對質(zhì)量提取率的影響：從圖4可知，提取率隨著提取次數(shù)的增加而增大，提取3次時達(dá)到最大10.03%，由于提取3次與提取4次的提取率相差不大，從節(jié)約成本、時間的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為3次提取已經(jīng)較為充分，效果較好，選擇最佳的提取次數(shù)為3次。見圖4。

圖4 提取次數(shù)對提取率的影響Fig.4 Effect of extract times on extraction yield

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。從表3的直觀分析結(jié)果、表4的方差分析結(jié)果可知：其中A、C、D因素均有顯著性差異、B因素沒有顯著性差異，C因素影響最大、其次是A因素、再次是D因素、B因素。即各因素對提取率的影響程度依次為提取次數(shù)>料液比>提取時間>浸泡時間。綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果，提取的最佳水平組合為A3B2C3D3即以1:30倍體積的溶劑浸泡藥物粉末2.0 h，加熱回流提取3次，每次提取2.0 h。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal test L9(34)

質(zhì)量提取率=冷凍干燥后提取物粉末質(zhì)量/毛蒟粗粉末質(zhì)量×100%

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Result of variance analysis

2.3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 測定的結(jié)果均優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中的任何一組，重現(xiàn)性很好，說明該工藝穩(wěn)定可行。見表5。

表5 最佳提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) (n=3)Tab.5 Verification test of the optimum extraction process(n=3)

2.4 定性檢測結(jié)果 總提物、水洗物、醇洗物初步定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6、圖5。

表6 定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of qualitative detection experiment

+：反應(yīng)陽性；-反應(yīng)陰性

圖5 定性檢測結(jié)果1.對照液；2.粗提液；3.醇提液；4.水洗液Fig.5 Results of qualitative detection experiment1.control solution; 2.crude extracts; 3.ethanol extracts; 4.water extracts

3 討論

中藥有效成分的提取工藝考察，是通過比較不同的提取工藝參數(shù)，從中選擇一種有效成分溶出率高、操作簡單、成本消耗少的提取方法。由于藥材之間差別較大，每種植物中所含的成分不同，故其提取沒有一種通用的方法，在遵循浸提原理[8]的基礎(chǔ)上應(yīng)根據(jù)不同藥材特點(diǎn)、采用不同的方法。中藥在傳統(tǒng)應(yīng)用中均以水煎常見，在民間流傳用毛蒟煮水喝治療肝臟疾病很有效，說明其有效成分有可能是水溶性的，因此本實(shí)驗(yàn)選用了水提法。

大孔吸附樹脂具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨(dú)特，不受無機(jī)物存在的影響、再生簡便、解吸條件溫和、使用周期長、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于植物中有效成分的分離純化[9-10]，是提取分離中草藥有效成分的一種有效方法。該工藝操作簡便，成本較低，樹脂可反復(fù)使用，越來越受到人們的重視。綜合以上因素，本實(shí)驗(yàn)選擇了大孔樹脂對毛蒟粗提取液進(jìn)行初步的分離純化。

直觀分析結(jié)果及方差分析結(jié)果表明對提取率影響最大的是提取次數(shù)，其次是料液比和提取時間，影響最小的是浸泡時間；因此，在進(jìn)行提取時，必須注意各工藝參數(shù)的調(diào)控。提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次提取率均高于正交實(shí)驗(yàn)里任何一組，說明優(yōu)選出來的工藝參數(shù)組合是可行、穩(wěn)定的。

從總提物、水洗物、醇洗物的初步定性檢測結(jié)果可知，水洗物和醇洗物有些成分是交叉的，即水洗物與醇洗物中均含有，本實(shí)驗(yàn)只是初步分離，定性鑒定，后期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，需對藥理活性強(qiáng)的提取部位進(jìn)行深入的分離純化研究。

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(編校：王冬梅)

Analysis ofPiperpuberulum(Benth.) Maxim.extracts preparation and the preliminary qualitative chemical composition

YANG Yan1, WU Qin2, GONG Qi-hai2, XU Shi-bing3, SHI Jing-shan2Δ

(1.Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China; 2.Department of Pharmacology, Zunyi Medical College, Zunyi 563002, China; 3.Meitan People’s Hospital, Zunyi 564100, China)

ObjectiveTo investigate optimal extraction process ofPiperpuberulum(Benth.) Maxim.and qualitative analyze the chemical component of the extracts.MethodsMethod of solvent heating reflux was used for extraction.On the basis of single factor experiment, L9(34) orthogonal experiment was designed with the variants of extraction frequency, time, material-liquid ratio, and immersion time.Extraction rate as index, extraction processes were optimized to achieve best extraction.The extracts, including total extract, water elution, and ethanol elution, were physiochemically analysed to achieve an initial qualitative result.ResultsThe optimal extraction process was: extractions 3 times for 2 hours, with an 1︰30 material - liquid ratio and 2 hours of immersion, Initial qualitative analyzed the total extracts containing amino acids, polypeptides, proteins, alkaloids, steroids or triterpenes, flavones, saponins, polysaccharides, reducing sugars or glucosides, cumarins, terpene lactones, phenols, and tannins.The water elution containing: amino acids, polypeptides, proteins, saponins, polysaccharides, reducing sugars or glucosides, cumarins, and terpene lactones.The ethanol elution containing: amino acids, polypeptides, proteins, alkaloids, steroids or triterpenes, flavones, polysaccharides, reducing sugars or glucosides, phenols, and tanins.ConclusionThe experiments show that optimal extraction process can achieve high extraction yield, stable and practical.

Piperpuberulum(Benth.) Maxim.;extraction process;qualitative analysis; orthogonal experiment design

楊艷，女，碩士，副教授，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)工作，E-mail:ZYFYYYmY@163.com;石京山，通訊作者，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：shijs@zmc.edu.cn。

R284

A

1005-1678(2015)05-0169-05