陳宇，梁蔚陽(yáng)

(廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

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HPLC法測(cè)定小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸含量

(廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

目的 建立測(cè)定小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸含量的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)。方法 采用Agilent 1200型高效液相色譜儀，使用Agilent Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.0 mm，5 μm)，以20 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)-乙腈(90:10)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫25 ℃。結(jié)果 乙酰酪氨酸峰與其他氨基酸色譜峰分離度良好，乙酰酪氨酸在12.062～120.62 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，平均加樣回收率(n=9)為100.0%，RSD%(n=9)為0.9，其定量限(S/N=10)為0.15 μg/mL。結(jié)論 建立的HPLC法可用于小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸的質(zhì)量控制。

乙酰酪氨酸；小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)； HPLC

小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)是由19種氨基酸配制而成的滅菌水溶液，主要治療早產(chǎn)兒、低體重兒及各種病因所致不能經(jīng)口攝入蛋白質(zhì)或攝入量不足的新生兒和因燒傷、外傷及手術(shù)等高代謝狀態(tài)的小兒[1]。最近臨床上還將其與葉酸片、葡萄糖酸鋅或小劑量654-2片聯(lián)合用藥，用于治療小兒輪狀病毒感染性腸炎、遷延性腹瀉等疾病[2-5]。小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)原為北京制藥廠研發(fā)生產(chǎn)，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第48冊(cè)WS1-(X-507)-2003Z，其酪氨酸的處方量為1.4 mg/mL[6]。但酪氨酸在水中溶解度極低，約為0.5 mg/mL。經(jīng)過(guò)模擬處方試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如按標(biāo)準(zhǔn)處方量投料生產(chǎn)，樣品有大量結(jié)晶析出，說(shuō)明其處方存在問(wèn)題[7]。小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用紫外分光光度法測(cè)定酪氨酸含量，該方法專屬性低，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)得樣品中酪氨酸的量。

在前期的實(shí)驗(yàn)中，分別采用Waters AccQ-Tag法和Agilent OPA/FMOC法測(cè)定樣品中酪氨酸的含量，約為0.4 mg/mL[8-9]。上述2種方法的原理是利用衍生物與氨基酸的伯胺基或仲胺基發(fā)生反應(yīng)，生成具有熒光或紫外吸收的物質(zhì)，從而通過(guò)色譜分離測(cè)得吸收值[10]。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)分析，樣品中含有的物質(zhì)可能為分子結(jié)構(gòu)中帶有芳香環(huán)和叔胺基的乙酰酪氨酸。

本文擬通過(guò)HPLC法對(duì)乙酰酪氨酸與其他氨基酸進(jìn)行有效分離，考察小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)是否含有乙酰酪氨酸，并對(duì)其含量進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 酪氨酸、苯丙氨酸、乙酰酪氨酸、色氨酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：140609-201212、140676-200405、140672-200501、140686-201303)。生產(chǎn)企業(yè)A，樣品1批(批號(hào)：Y1211222)；生產(chǎn)企業(yè)B，樣品3批(批號(hào)：20130401，20130402，20130403)；生產(chǎn)企業(yè)C，樣品1批(批號(hào)：C13013104)。磷酸二氫鈉與磷酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；乙腈(色譜純，Merck)；超純水。

1.2 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent Hypersil ODS(250 mm×4.0 mm，5 μm)(美國(guó)Agilent公司)；Waters 2695/2487高效液相色譜儀、Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(美國(guó)Waters公司)；Millipore超純水發(fā)生儀(美國(guó)Millipore公司)；Sartorius PB-10 pH計(jì)(德國(guó)Sartorius公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱：Agilent Hypersil ODS(250 mm×4.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：20 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)-乙腈(90:10)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 溶液的制備

① 系統(tǒng)適用性溶液:取酪氨酸、苯丙氨酸、乙酰酪氨酸和色氨酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每 1 mL 中約含酪氨酸16 μg、苯丙氨酸116 μg、乙酰酪氨酸48 μg和色氨酸48 μg的混合溶液，即得。

② 對(duì)照品溶液:精密稱取乙酰酪氨酸適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中約含48 μg的溶液，即得。

③ 供試品溶液:精密量取本品適量，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中約含乙酰酪氨酸48 μg的溶液，即得。

1.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn):取“1.3.2”項(xiàng)下的①溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.3.4 線性試驗(yàn)：精密稱取乙酰酪氨酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成含乙酰酪氨酸12.062～120.62 μg/mL的溶液，參照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.5 定量限與檢測(cè)限：取“1.3.2”項(xiàng)下的②對(duì)照品溶液逐級(jí)定量稀釋，進(jìn)樣并記錄色譜圖，按信噪比(S/N)分別為10和3計(jì)算定量限和檢測(cè)限。

1.3.6 精密度試驗(yàn)：精密量取“1.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)：取生產(chǎn)企業(yè)B(批號(hào)：20130401)的樣品，參照“1.3.2”項(xiàng)下③的方法配制供試品溶液6份，按“1.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣。

1.3.8 加樣回收率試驗(yàn)：取乙酰酪氨酸對(duì)照品分別用流動(dòng)相溶解并稀釋至成濃度為0.96、1.2、1.44 mg/mL的貯備液，精密量取上述溶液1 mL，分別置50 mL量瓶中，加入同批號(hào)樣品(生產(chǎn)企業(yè)A，批號(hào)為20130401，乙酰酪氨酸為1.2 mg/mL)1 mL，按“1.3.1”項(xiàng)下的方法配制加樣回收率溶液，各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。

1.4 樣品測(cè)定 參照“1.3.2”項(xiàng)下的方法配制對(duì)照品溶液與供試品溶液，參照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算乙酰酪氨酸的含量。

1.5 耐用性試驗(yàn) 除高效液相色譜儀為Waters 2695/2487檢測(cè)器，色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)外，其他按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算乙酰酪氨酸的含量。

1.6 結(jié)果比較 參考小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-507)-2003Z，采用紫外分光光度法對(duì)5批樣品的酪氨酸含量進(jìn)行測(cè)定，與采用Waters AccQ-Tag和HPLC法測(cè)得酪氨酸與乙酰酪氨酸的量進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 乙酰酪氨酸的保留時(shí)間約為5.8 min，乙酰酪氨酸峰與苯丙氨酸峰、乙酰酪氨酸峰與色氨酸峰的分離度均為6.6，理論板數(shù)按乙酰酪氨酸峰計(jì)為12107，見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)圖譜Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

2.2 線性試驗(yàn) 以進(jìn)樣濃度(X,μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=11.38X-1.092，相關(guān)系數(shù)為0.9999。結(jié)果表明，乙酰酪氨酸在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 定量限和檢測(cè)限試驗(yàn) 乙酰酪氨酸的定量限為0.15 μg/mL，檢測(cè)限為0.05 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn) 精密度試驗(yàn)測(cè)定其峰面積的RSD(n=6)為0.1%。表明儀器的精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)表明乙酰酪氨酸峰面積的RSD(n=6)為0.5%。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 乙酰酪氨酸的加樣回收率為100.0%，RSD值為0.9%。結(jié)果表明，該方法有良好的回收率。

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果 樣品測(cè)定結(jié)果及耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表1，圖2。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果及耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Determination and robustness results of samples

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the sample

2.7 不同測(cè)定方法的結(jié)果比較 不同方法測(cè)定酪氨酸與乙酰酪氨酸的含量比較，見表2。

表2 結(jié)果比較Tab.2 Comparison of results

3 討論

大多數(shù)高效液相色譜法測(cè)定氨基酸含量的原理是利用衍生物與氨基酸的伯胺基或仲胺基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成具有熒光或紫外吸收的物質(zhì)，從而通過(guò)色譜分離測(cè)得吸收值。采用Waters AccQ-Tag方法對(duì)以上5批樣品進(jìn)行氨基酸含量分析，其酪氨酸含量均約為0.4 mg/mL，低于酪氨酸處方量(1.4 mg/mL)，說(shuō)明可能存在生產(chǎn)企業(yè)未按申報(bào)的工藝進(jìn)行生產(chǎn)的情況。5批樣品中乙酰酪氨酸的量(以酪氨酸計(jì))與酪氨酸的量之和約為1.4 mg/mL，與其處方量接近，說(shuō)明處方中酪氨酸的量是乙酰酪氨酸與酪氨酸的含量之和。

小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，采用紫外分光光度法測(cè)定酪氨酸的量，其專屬性差，不能有效分離酪氨酸與乙酰酪氨酸。采用高效液相色譜法對(duì)小兒復(fù)方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸的量進(jìn)行測(cè)定，能有效控制其質(zhì)量。

在試驗(yàn)過(guò)程中使用Waters Symmetry C18與Agilent Hypersil ODS色譜柱時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙酰酪氨酸與色氨酸的出峰順序倒置，可能是由于不同品牌的C18色譜柱填料存在一定差異造成的。使用以上2種色譜柱時(shí)，乙酰酪氨酸峰與相鄰氨基酸色譜峰均能達(dá)到分離度的要求，不影響測(cè)定結(jié)果。

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(編校：王冬梅)

Determination of content of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ) by HPLC

CHEN Yu-kun, LIANG Wei-yangΔ

(Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China)

ObjectiveTo establish a method for HPLC to determine content of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ).MethodsThe chromatographic separation was achieved on a Agilent Hypersil ODS column (250 mm×4.0 mm,5 μm) with Agilent 1200 liquid chromatography system.The mobile phases consisted of 20 mmol/L sodium dihydrogen phosphate solution (adjusting pH to 2.5 with phosphoric acid)-acetonitrile (90:10) at a flow rate of 1.0 mL/min, the detection wavelength was 210 nm, the column temperature was 25 ℃.ResultsAcetyl tyrosine was completely separated from other amino acids.The calibration curves for acetyl tyrosine revealed good linearity in the range of 12.062-120.62 μg/mL(r=0.9999).The average recoveries (n=9) of acetyl tyrosine was 100.0%, RSD% (n=9) was 0.9.The limits of quantification (S/N=10) was 0.15 μg/mL.ConclusionThe methodological validation results indicate that the established method can be applied to quality control of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ).

acetyl tyrosine;pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ);HPLC

陳宇堃，女，本科，主管藥師，研究方向：生化藥品檢驗(yàn)，E-mail:bettycyk@163.com；梁蔚陽(yáng),通訊作者,女，碩士，主任藥師，研究方向：生化藥品及生物制品質(zhì)量控制工作；E-mail: wl-1023@163.com。

R927.2

A

1005-1678(2015)05-0166-03