方獻平, 朱麗敏, 劉凱, 阮松林, 許寶青, 謝楠, 蔡麗娟, 劉新軼, 戴瑜來, 馮曉宇, 李忠全*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院生物技術研究所,杭州310024；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院水產(chǎn)研究所,杭州310024)

定量蛋白質(zhì)組學揭示三角魴和團頭魴響應嗜水氣單胞菌侵染機制變化

方獻平1, 朱麗敏2, 劉凱2, 阮松林1, 許寶青2, 謝楠2, 蔡麗娟2, 劉新軼2, 戴瑜來2, 馮曉宇2, 李忠全2*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院生物技術研究所,杭州310024；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院水產(chǎn)研究所,杭州310024)

細菌性敗血癥對魚類危害嚴重,為探究魴屬魚類不同抗性品種響應病原菌嗜水氣單胞菌的抗性機制,以三角魴(高抗)和團頭魴(易感)肝組織為材料,采用非標記定量蛋白質(zhì)組學技術分析其在嗜水氣單胞菌侵染脅迫后3、10和24 h與對照組0 h(未感染)肝組織蛋白質(zhì)組的變化,對差異表達蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定、相對定量和生物信息學分析。結(jié)果顯示:三角魴和團頭魴在嗜水氣單胞菌侵染下,分別有46個和29個蛋白質(zhì)在侵染后各時期的表達豐度相比對照都發(fā)生了顯著變化。通過基因本體(gene ontology,GO)功能注釋發(fā)現(xiàn),相對于團頭魴,三角魴中氧化還原蛋白質(zhì)比例從7%增加到13%,且發(fā)現(xiàn)一類新的β-免疫球蛋白(β-globin)在各時期分別上調(diào)表達了1.64、3.44和1.93倍。生物信息學分析進一步表明,三角魴在響應嗜水氣單胞菌侵染過程中可能特異性地啟動了包括戊糖磷酸途徑、脂肪酸代謝、亮氨酸代謝途徑和β-globin高表達的協(xié)同抗性機制,從而抵御病原菌入侵。該研究成果為后續(xù)深入揭示魚病互作分子機制及魴屬魚類抗病新品種選育提供了重要的前期理論研究基礎。

三角魴; 團頭魴; 嗜水氣單胞菌; 定量蛋白質(zhì)組學

魴屬(Megalobrama)魚類隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Culterinae),主要包括三角魴(Megalobramaterminalis)、團頭魴(Megalobramaamblycephala)、厚頜魴(Megalobramapellegrini)和廣東魴(Megalobramahoffmanni)4種。三角魴為魴屬最大個體種類(2+齡),它主要分布于南嶺以北至黑龍江各淡水水系,棲息于中下水層,在自然條件下以黃蜆、螺螄、小蝦等為食,為偏肉食的雜食性魚類,在人工養(yǎng)殖條件下可攝食人工配合飼料。目前,團頭魴為魴屬魚類中養(yǎng)殖量最大種類。近年來,團頭魴細菌性敗血癥頻發(fā),嚴重影響?zhàn)B殖效益，而三角魴養(yǎng)殖過程中未發(fā)現(xiàn)有大規(guī)模病害出現(xiàn)。因此,三角魴越來越受到養(yǎng)殖戶的青睞,在全國推廣面積不斷擴大，而團頭魴抗病性差,養(yǎng)殖治病成本高,難以實現(xiàn)無公害養(yǎng)殖。

細菌性敗血癥是團頭魴的主要病害,流行季節(jié)長,發(fā)病時往往造成魚大批病死,病死率高達70%以上。據(jù)報道,此病在湖北、湖南、江西、福建、江蘇和上海等省市均有流行。魚體長2.5～15 cm均有發(fā)病,2齡以上的團頭魴也有發(fā)病，在水溫20～33 ℃時發(fā)生流行,最適流行水溫為27～30 ℃。當水質(zhì)惡化,水中溶氧低,透明度低,水中總氮、有機氮、亞硝酸態(tài)氮和有機物耗氧量高時最為流行,即使水溫在12 ℃或34 ℃時也發(fā)病。團頭魴感染敗血癥一般分3個階段：一是潛伏期。在此期間,魚的外表未顯示出任何癥狀,活動與攝食正常。潛伏期的長短與水溫及細菌濃度有密切關系,水溫高,細菌濃度高,潛伏期短；反之,則長。二是前趨期。時間短,僅1～2 d左右,魚的體色發(fā)暗變黑,離群獨游,停止攝食。三是發(fā)展期。時間長短不一,一般為2～3 d,病魚表現(xiàn)充血、出血癥狀而病死。

隨著研究的日漸深入及其相關技術的不斷完善,蛋白質(zhì)組學作為當今生命科學的研究熱點,已經(jīng)成為生物學中破譯基因功能、貢獻于育種程序和探討相關病害抗性機制的重要途徑。如今,蛋白質(zhì)組學技術已經(jīng)成為研究外界脅迫誘導動植物響應機制的強有力工具[1-2]。陳強等[3]利用雙向電泳技術對陸封型和洄游型香魚體腎組織進行差異蛋白質(zhì)組學分析,發(fā)現(xiàn)環(huán)境應激和能量代謝等層面有明顯的蛋白質(zhì)表達差異；朱佳杰等[4-5]建立和優(yōu)化了吉富羅非魚肝蛋白質(zhì)組雙向電泳技術體系,并進一步研究了吉富羅非魚肝在無乳鏈球菌脅迫下發(fā)生的蛋白質(zhì)組變化；李明云等[6]研究了低溫脅迫下大黃魚肝蛋白質(zhì)組變化。由此可見,蛋白質(zhì)組學技術已經(jīng)被廣泛用于各種魚類的生長發(fā)育和抗逆機制研究,在魚類的生物化學及其分子機制解析中發(fā)揮了重要的作用。

三角魴和團頭魴同為魴類,親緣關系相近,但兩者的抗病性差異卻很大。因此,本研究試圖利用非標記定量蛋白質(zhì)組學技術比較三角魴和團頭魴對細菌性敗血癥病菌響應的蛋白質(zhì)組表達差異,找出三角魴對細菌性敗血癥病菌特異響應的蛋白質(zhì),以期闡明其抗病性機制,為今后抗病基因克隆和分子育種及生物抗病制劑研發(fā)提供重要研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用三角魴和團頭魴由浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院水產(chǎn)研究所提供,嗜水氣單胞菌株分離來自江蘇武進某養(yǎng)殖場(經(jīng)過回歸再分離),采用VITEK-32全自動細菌鑒定儀鑒定。

1.2 致病性實驗

選擇體表無傷的健康三角魴和團頭魴作為實驗對象,分別設5組,每組10尾。將分離純化的24 h培養(yǎng)物,用無菌0.75%氯化鈉溶液洗下菌苔,制成含量為5.0×1010、5.0×108、5.0×106和5.0×104CFU/mL的菌懸液,進行腹腔注射感染,注射劑量0.1 mL/尾。同時設對照組,注射0.1 mL/尾的0.75%氯化鈉溶液。置水族玻璃缸飼養(yǎng)24 h,水溫控制在(20±2) ℃,觀察結(jié)果,計算半數(shù)致死量LD50,用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。經(jīng)實驗計算確定菌株對三角魴和團頭魴的半數(shù)致死量LD50分別為1.05×108和5.90×106CFU/mL。解剖觀察病死魚,發(fā)現(xiàn)肝腫大,腎、腸道充血,與養(yǎng)殖中發(fā)病癥狀基本相同,對照組未見明顯異常癥狀,試驗魚活動、攝食正常。選擇健康體形大小均一的三角魴和團頭魴各20尾,體質(zhì)量130.5～150.5 g,對魚體進行嗜水氣單胞菌腹腔注射。實驗所用致病菌劑量為108CFU/mL,注射量為0.1 mL/尾,分別于感染0、3、10和24 h各取1次樣,每次(每個時間點)各取魚5尾(具體實驗線路見圖1),在冰上進行活體解剖后取肝組織,放入凍存管稱量,液氮凍存帶回實驗室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肝蛋白質(zhì)的提取及定量

分別將每次樣的5尾魚的肝組織混合剪碎,盡量去除脂肪組織和結(jié)締組織等非目的組織,加入適量的冰冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次后,4 ℃,800 r/min離心2 min,去上清液,取沉淀組織放入研缽中,加入適量液氮進行研磨至粉末狀。稱取0.1 g粉末,加入1 mL裂解液(8 mol/L尿素、10 mmol/L二硫蘇糖醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸和1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中,振蕩混勻,4 ℃放置1 h,期間取出振蕩3～5次；再于4 ℃,13 000 r/min高速離心20 min以沉淀組織碎片,取上清液后用預冷的丙酮沉淀,再用裂解液復溶即為肝組織總蛋白質(zhì),用考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)定量并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測總蛋白質(zhì)提取質(zhì)量,分裝并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白質(zhì)溶液內(nèi)酶解與除鹽

取約100 μg蛋白質(zhì)樣本酶解,按1/10體積加入100 mmol/L二硫蘇糖醇(Sigma公司)至最終為10 mmol/L,56 ℃還原反應1 h。冷卻至室溫后,按1/10體積加入500 mmol/L碘乙酰胺(Sigma公司)至最終為50 mmol/L,避光反應45 min。按1/10體積加入100%的三氯乙酸(Sigma公司)至最終為10%,4 ℃沉淀2 h，用冷丙酮洗3次后離心得沉淀顆粒,溶于100 mmol/L NH4HCO3,超聲5 min。在此蛋白質(zhì)混合物中,按酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1∶50加入胰酶(Promega公司),37 ℃反應12 h，為保證充分酶解,12 h后再按上述比例加入胰酶,37 ℃反應4 h。酶解后的肽段經(jīng)凱杰公司的C18柱除鹽,后進行真空干燥。

1.5 液質(zhì)鑒定與差異蛋白質(zhì)相對定量分析

將真空干燥后的肽段,用0.1%甲酸的水溶液復溶至0.5 μg/μL,在轉(zhuǎn)速為13 000 r/min下離心10 min,除去不溶物質(zhì),每個組分上樣4 μL(約2 μg蛋白質(zhì))。采用EASY-nLC 1000納升級液相色譜和Q-Exactive高分辨率質(zhì)譜液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(Thermo Fisher公司),對各個時期的樣品肽段進行LC-MS/MS鑒定。流動相A液:含0.1%甲酸(Thermo Fisher公司)的水溶液;B液:含0.1%甲酸的乙腈(Thermo Fisher公司)。線性洗脫梯度(B液):1%～40%,120 min；40%～65%,5 min；65%,保持5 min；65%～1%,1 min；1%,20 min平衡。流速為200 nL/min。Q-Exactive質(zhì)譜掃描范圍m/z為350～1 800,每個一級譜圖自動選擇3個最強母離子進行二級掃描,每個樣品質(zhì)譜鑒定為3次重復。

鑒于三角魴和團頭魴為非模式生物,基因組序列未知,所以蛋白質(zhì)搜庫為NCBI中斑馬魚模式生物數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein,Daniorerio,81514 sequences)進行同源搜庫比對,搜庫鑒定軟件為Proteome Discoverer 1.4,借助Thermo Fisher Sieve 2.2軟件對差異表達的蛋白質(zhì)譜峰強度比對,進行相對定量分析(P<0.05)。

1.6 實時熒光定量PCR分析

為了進一步了解通過蛋白質(zhì)組學篩查得到的蛋白質(zhì)對應的mRNA表達情況,我們選取了蛋白質(zhì)組學中4個蛋白質(zhì)(NCBI搜庫編號分別為18858695、56744251、41056111和50539724)對應的基因進行了mRNA表達水平的分析。在NCBI中利用BLASTp比對挑選每個蛋白質(zhì)的同源序列,利用CODEHOP軟件在保守區(qū)設計簡并引物(GDP),擴增cDNA中間片段,使用軟件Primer 5.0設計5′端和3′端的RACE擴增特異性引物(GSP)。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。本實驗中所用到的引物序列及相應的退火溫度(Tm)見表1。

提取魚肝總RNA,合成cDNA第1鏈,分別采用各基因的簡并引物GDP-S和GDP-A擴增cDNA中間片段。利用基因特異性引物5′-GSP和3′-GSP繼續(xù)進行5′端和3′端的RACE反應。對PCR產(chǎn)物進行電泳、切膠純化、連接、轉(zhuǎn)化和測序,利用軟件拼接各基因全長cDNA序列。根據(jù)拼接序列設計全長特異上下游引物GFP-S和GFP-A,PCR擴增各基因全長cDNA序列。

分別提取不同病菌處理樣本總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。以磷酸甘油醛脫氫酶基因(登記號：BC083506)作為內(nèi)參,根據(jù)內(nèi)參基因序列和各基因cDNA全長序列設計定量PCR引物GRTP-S和GRTP-A,利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix Kit (Toyobo, Japan)在ABI PRISM 7500實時定量PCR儀上進行PCR反應。樣本和內(nèi)參分別設定3個重復,以0 h處理作為對照,以各取樣時間點內(nèi)參基因的表達量為標準來確定目標基因的相對表達量。根據(jù)測得的CT值,利用2-ΔΔCT法計算不同侵染時期各基因的相對表達量。

表1 基因RT-PCR引物

1.7 生物信息學分析

利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.uniprot.org)對所鑒定的各蛋白質(zhì)進行基因本體(gene ontology,GO)注釋,依據(jù)細胞學組分、分子功能及生物學過程屬性,對三角魴和團頭魴不同時期表達的共性差異蛋白質(zhì)分別進行GO分析。用MultiExperiment Viewer 4.3軟件對差異蛋白質(zhì)進行差異表達圖譜聚類分析。利用KEGG的網(wǎng)絡信號數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)對鑒定到的重要差異蛋白質(zhì)進行匹配,挖掘在病菌侵染下,由差異蛋白質(zhì)表達變化導致發(fā)生改變的重要代謝信號通路(P<0.05)。總體實驗方案設計思路如圖1。

圖1 實驗設計流程圖Fig.1 Flow chart of experimental design

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌脅迫下三角魴和團頭魴肝組織蛋白質(zhì)組變化

在嗜水氣單胞菌的侵染下,三角魴肝組織蛋白質(zhì)在侵染后0、3、10和24 h檢測匹配鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)分別為138、274、243和152個。其中由于病菌侵染,造成4個時期發(fā)生表達變化的共性差異蛋白質(zhì)為46個(圖2A,表2)。相應在嗜水氣單胞菌的侵染0、3、10和24 h后,團頭魴肝組織檢測鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)分別為192、194、271和125個,其中不同時期共性應答差異蛋白質(zhì)29個(圖2B和表3)。從三角魴和團頭魴應答蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布范圍來看,兩者應答蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小分布類似,分子質(zhì)量大部分也都集中在pI 5～11之間；三角魴中應答蛋白質(zhì)則更多傾向于堿性蛋白質(zhì),較為明顯地聚集成pI 7～9和pI 9～10的2個類群,而團頭魴中應答蛋白質(zhì)在此范圍等電點分布較為均勻(圖2C,D)。

A:三角魴在病菌侵染后鑒定到的蛋白質(zhì)個數(shù)韋恩圖；B:團頭魴在病菌侵染后鑒定到的蛋白質(zhì)個數(shù)韋恩圖；C:三角魴不同時間點的46個共性應答蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及等電點分布示意圖；D:團頭魴不同時間點的29個共性應答蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及等電點分布示意圖。 A: Venn chart of the identified proteins in M. terminalis; B: Venn chart of the identified proteins in M. amblycephala; C: Schematic diagram of 46 proteins in M. terminalis based on molecular mass and isoelectric point; D: Schematic diagram of 29 proteins in M. amblycephala based on molecular mass and isoelectric point.圖2 三角魴和團頭魴肝在嗜水氣單胞菌侵染不同時間點應答蛋白質(zhì)鑒定個數(shù)情況圖Fig.2 Summary charts of total identified responsive proteins of M. terminalis and M. amblycephala infected with A. hydrophila at different time points

表2 三角魴肝感染嗜水氣單胞菌不同時間點的46個共性差異蛋白質(zhì)表達變化情況

續(xù)表2 三角魴肝感染嗜水氣單胞菌不同時間點的46個共性差異蛋白質(zhì)表達變化情況

表3 團頭魴肝感染嗜水氣單胞菌不同時間點的29個共性差異蛋白質(zhì)表達變化情況

2.2 部分蛋白質(zhì)mRNA在不同侵染時期的表達情況

為了進一步探索和驗證部分發(fā)育相關蛋白質(zhì)mRNA在不同侵染時期的表達變化,我們選取了4個蛋白質(zhì)進行對應mRNA表達水平分析。實驗表明,在不同發(fā)育階段,丙酮酸羧化酶(圖3A)、過氧化氫酶(圖3B)和尿酸氧化酶(圖3D)在轉(zhuǎn)錄水平上的變化趨勢與蛋白質(zhì)表達水平呈現(xiàn)較好的一致性,而葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(圖3C)在蛋白質(zhì)和mRNA的表達變化趨勢上并不很一致,甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)增高,而蛋白質(zhì)卻有表達程度下調(diào)的情況。出現(xiàn)這一現(xiàn)象原因可能是部分mRNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、降解和翻譯后修飾等的影響,從而導致了后期蛋白質(zhì)翻譯表達水平的降低。

A:丙酮酸羧化酶；B:過氧化氫酶；C:葡萄糖磷酸異構(gòu)酶；D:尿酸氧化酶.A: Pyruvate carboxylase； B: Catalase； C: Phosphoglucomutase； D: Uricase.圖3 4個蛋白質(zhì)與其對應mRNA的表達變化情況Fig.3 mRNA and protein expression levels of four protein and corresponding genes

圖4 三角魴和團頭魴分別響應嗜水氣單胞菌侵染的不同時間點共性應答蛋白質(zhì)的基因本體分析餅狀圖Fig.4 Pie charts of common identified responsive proteins of M. terminalis and M. amblycephala infected with A. hydrophila at different time points based on gene ontology

2.3 差異表達蛋白質(zhì)GO注釋功能分析

對三角魴和團頭魴的差異應答蛋白質(zhì)進行GO功能注釋。在應答蛋白質(zhì)參與生物學過程中,發(fā)現(xiàn)2種魚類對病菌的響應蛋白質(zhì)多集中在糖類合成代謝、丙酮酸代謝、碳水化合物合成分解、轉(zhuǎn)錄翻譯和氧化還原等生物過程中；而高抗品種三角魴對嗜水氣單胞菌的響應中出現(xiàn)了更多地參與氧化還原反應的蛋白質(zhì)(13%),并且發(fā)現(xiàn)了參與低氧反應相關的蛋白質(zhì)(圖4A,B)。在對兩者的響應蛋白質(zhì)進行細胞組分分析時發(fā)現(xiàn),差異蛋白質(zhì)往往富集在內(nèi)膜細胞器、核糖體和核蛋白復合體等區(qū)域，而團頭魴應答病菌脅迫過程中出現(xiàn)了參與中間纖維組成的響應蛋白質(zhì),三角魴出現(xiàn)的特異應答蛋白質(zhì)中有15%和3%分別富集在無膜細胞器和珠蛋白復合體中(圖4C,D)。在對兩者響應蛋白質(zhì)的分子功能聚類時發(fā)現(xiàn),除了兩者應答蛋白質(zhì)中共同參與的結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體結(jié)構(gòu)組成、維生素連接和輔酶連接等分子功能之外,嗜水氣單胞菌誘導高抗品種三角魴中參與血紅素連接和氧氣轉(zhuǎn)運的相關蛋白質(zhì)活性發(fā)生了變化(圖4E,F)。

2.4 差異表達蛋白質(zhì)表達圖譜聚類分析

用MultiExperiment Viewer軟件對三角魴和團頭魴的定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)：在嗜水氣單胞菌的侵染下,團頭魴肝中約40%的蛋白質(zhì)表達發(fā)生上調(diào),包括丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和尿酸氧化酶等；其他蛋白質(zhì)如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶和β-球蛋白等表達豐度都發(fā)生了下調(diào)。而三角魴肝約達70%的蛋白質(zhì)表達豐度增強(圖5),如有與團頭魴中同樣監(jiān)測到表達豐度上調(diào)的丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶,以及酰輔酶A脫氫酶和存在于線粒體內(nèi)的延胡索酸水化酶等,還有部分蛋白質(zhì)如磷酸葡萄糖變位酶在三角魴中表達上調(diào),而團頭魴中卻呈表達下調(diào)趨勢；揭示三角魴在病菌侵染時可能啟動了更多的基因參與翻譯表達更多的抗性蛋白質(zhì),從而抵御嗜水氣單胞菌的侵染。

紅色表示蛋白質(zhì)表達上調(diào),綠色表示下調(diào).A:三角魴在不同時間點46個共性應答蛋白質(zhì)聚類分析圖；B:團頭魴在不同時間點29個共性應答蛋白質(zhì)聚類分析圖。 Red indicates up-regulation, and green indicates down-regulation. A: Clustering chart of 46 proteins in M. terminalis; B: Clustering chart of 29 proteins in M. amblycephala. 圖5 嗜水氣單胞菌侵染下三角魴和團頭魴應答蛋白質(zhì)的聚類表達分析圖Fig.5 Clustering charts of common identified responsive proteins of M. terminalis and M. amblycephala infected with A. hydrophila at different time points based on expression level

表示在應答蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)參與該代謝通路的蛋白質(zhì)個數(shù)。A:三角魴在病菌不同時間點共性應答蛋白質(zhì)團頭魴的響應蛋白質(zhì)參與的代謝信號路徑；B:團頭魴在病菌不同時間點共性應答蛋白質(zhì)團頭魴的響應蛋白質(zhì)參與的代謝信號路徑。 indicates the number of corresponding proteins found in each pathway. A： Pathway involving in the A. hydrophila-resistence process of M. terminalis； B： Pathway involving in the A. hydrophila-resistence process of M. amblycephala。 圖6 嗜水氣單胞菌侵染下三角魴和團頭魴應答蛋白質(zhì)參與的代謝通路Fig.6 Pathway involving in the A. hydrophila-resistence process of M. terminalis and M. amblycephala

2.5 病菌侵染下不同的代謝信號應答通路

將非標記定量蛋白質(zhì)組學結(jié)果比對KEGG的信號通路發(fā)現(xiàn)：在嗜水氣單胞菌的侵染下,團頭魴中包括糖酵解與異生、核糖體生成、三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝等多條代謝通路都發(fā)生了變化(圖6)。團頭魴和三角魴中鑒定到的甘油醛-3-磷酸脫氫酶、葡萄糖磷酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和丙酮酸羧激酶等都參與了糖酵解與糖異生途徑,但是大部分在此途徑中鑒定到的酶類如葡萄糖磷酸變位酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶在2種魚類應答病菌侵染過程中表達程度都有所不同。在參與核糖體生成的途徑中,團頭魴中鑒定到了核糖體蛋白L7、S14、L18a、S20和S30,三角魴中發(fā)現(xiàn)了核糖體蛋白S3、S19、S23、L18和L19等表達程度都發(fā)生了明顯變化。在參與三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝過程中,2種魚類都無一例外地發(fā)現(xiàn)了丙酮酸羧化酶和羧激酶在病菌侵染后表達程度發(fā)生了改變(表2,表3)。更為重要的是,三角魴中除了上述幾條共同的應答途徑外,還啟動了包括戊糖磷酸途徑、脂肪酸代謝和亮氨酸代謝等更多的代謝信號通路,揭示這些信號代謝途徑的參與很可能在三角魴抵御嗜水氣單胞菌的侵染過程中發(fā)揮的重要作用。

3 討論

肝是物質(zhì)代謝、清除毒素和參與各種抗病信號轉(zhuǎn)換的重要器官。肝除了參與各種代謝外,不僅可以促成多種紅細胞和血漿蛋白質(zhì)的生成,起到對外源物質(zhì)的解毒作用,還可以參與脂肪酸代謝,將脂肪酸運送到其他部位。由于肝良好的代謝能力和解毒作用,本研究利用非標定量蛋白質(zhì)組學技術探究了不同魴類抗性品種對嗜水氣單胞菌的抗性機制。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌誘使三角魴調(diào)動了更多的基因差異表達,引起了更多的蛋白質(zhì)豐度上的差異變化,從而在代謝信號通路上采取了更多的病菌防御策略,以下著重對這些病菌侵染下不同響應的代謝通路作一討論。

3.1 三角魴和團頭魴在嗜水氣單胞菌侵染下共同應答的代謝途徑

3.1.1 糖酵解與糖異生途徑 糖酵解是指細胞在細胞質(zhì)中分解葡萄糖生成丙酮酸的過程,而糖異生與糖酵解相反,是由簡單的非糖前體轉(zhuǎn)變?yōu)樘堑南盗袕碗s過程。生物體在病菌侵染過程中,除了核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生快速反應之外,糖類物質(zhì)也往往參與應答過程中[7-8]。病菌的侵染與宿主對病菌的抗性抵御反應之間所需的能量消耗,必然存在的強烈的競爭關系,碳水化合物代謝在其中會起到重要的生理作用,病原菌的侵入往往使宿主體內(nèi)的糖含量發(fā)生明顯改變[9-10]。本研究中發(fā)現(xiàn)無論在高抗品種三角魴還是易感品種團頭魴中,糖代謝是2類魚采取的最為主要的應答途徑之一,揭示糖代謝的變化與2類魚的抗病反應之間有著密切的關系,也說明糖代謝往往是生物體逆境脅迫過程的重要應答途徑之一[11]。

3.1.2 核糖體生成、三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝 核糖體是生物體內(nèi)合成各種蛋白質(zhì)的重要器官,主要由核糖體RNA和核糖體蛋白組成，核糖體蛋白不僅能參與新蛋白質(zhì)的生物合成,而且能參與DNA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中,調(diào)控細胞凋亡和轉(zhuǎn)化,積極參與動植物的逆境脅迫過程[12]。本研究過程中發(fā)現(xiàn),2種魚類肝中有大量的核糖體蛋白(如S20、S30、S23、L18和L19等)表達豐度在嗜水氣單胞菌的應答過程中都發(fā)生了重要改變,提示核糖體生成很有可能是魚類參與抗病反應的因素之一。另外,本研究中還發(fā)現(xiàn),三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝中有關的酶(丙酮酸羧化酶和羧激酶)活性在病原菌侵染后發(fā)生明顯改變,很可能意味著這些酶活性的改變,可進一步誘導和激活體內(nèi)代謝系統(tǒng),從而增強魚體的抗病性。

3.2 三角魴在嗜水氣單胞菌侵染下特異應答的代謝途徑

3.2.1 戊糖磷酸途徑 戊糖磷酸途徑是除了糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑以外的另一條非常重要的糖類代謝通路。不同于糖酵解和三羧酸循環(huán),戊糖磷酸途徑生成了很多中間產(chǎn)物,如丙糖、丁糖和戊糖等,最后轉(zhuǎn)化為磷酸果糖[13]。在團頭魴和三角魴的抗病反應中,戊糖磷酸途徑開始參與到三角魴抗病反應中,這一現(xiàn)象的原因很有可能是三角魴在嗜水氣單胞菌脅迫過程中,啟動了戊糖磷酸途徑在其他糖類代謝途徑中的比例,除了供給動物本身抗逆反應所需的能量之外,還生成很多的中間產(chǎn)物,積極緊密地參與到其他代謝過程中起到協(xié)同抗性作用,如戊糖磷酸途徑中的磷酸核酮糖是合成DNA的原料,磷酸己糖和磷酸丙糖可以重新進入糖酵解途徑。

3.2.2 脂肪酸代謝和氨基酸代謝 脂肪酸對于維持細胞膜完整性、調(diào)節(jié)細胞的免疫功能意義重大。很多研究表明脂肪酸在魚類的抗病免疫中都發(fā)揮著重要作用[14-24]。如脂肪酸值的增大能增加魚體內(nèi)的過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性[17],往魚飼料中添加脂肪酸能增加大菱鲆的溶菌酶活性[18],Puangkaew等[21]在虹鱒魚體內(nèi)增加脂肪酸的實驗中,更是檢測到了魚巨噬細胞中細菌能力的提高和免疫抗體的增加。本研究中發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝通路中關鍵酶乙酰輔酶A脫氫酶在病菌侵染后活性持續(xù)增強,而乙醛脫氫酶在經(jīng)歷前期的下調(diào)后也開始表達上升,說明在三角魴肝中脂肪酸代謝通路中相關酶活性的高強度表達,是生成相關脂肪酸產(chǎn)物抵御病菌侵染的積極反應。本研究中發(fā)現(xiàn)的參與氨基酸代謝相關的酶類,主要集中在亮氨酸和異亮氨酸的代謝通路上,揭示亮氨酸及其異構(gòu)體在三角魴抗病反應中可能發(fā)揮一定的作用。

3.3β-球蛋白

目前,對于草魚、鱖魚、牙鲆、石斑魚和斑馬魚等都進行了相應的免疫球蛋白的研究[25-27],免疫球蛋白已經(jīng)被越來越多的實驗證實在魚類抗病研究中發(fā)揮著重要作用[28]。如果能針對免疫球蛋白的抗原表位,制備生產(chǎn)相應的單克隆或多克隆抗體,從而對魚類免疫器官中產(chǎn)生抗體的細胞或組織進行定位研究,探索免疫器官在疾病防御中的響應機制,對魚類應用疫苗的研發(fā)也具有重要的指導意義。本研究中發(fā)現(xiàn)了三角魴肝內(nèi)一類重要β-球蛋白在病原菌侵染后各時期分別比對照增強表達了1.64、3.44和1.93倍。β-球蛋白在本研究中高強度表達有著極為重要的科學意義,預示其很有可能是作為嗜水氣單胞菌抗病相關的一類免疫球蛋白,對其進行后續(xù)深入研究具有一定的價值意義。

4 結(jié)論

綜上所述,本研究定量分析了不同感抗品種團頭魴和三角魴感染嗜水氣單胞菌前后4個時期肝組織蛋白質(zhì)組的表達變化,發(fā)現(xiàn)了不同抗性魚類品種之間的差異信號響應通路,預示了不同抗性魚類品種對嗜水氣單胞菌的可能抗性應答機制。本研究結(jié)果為進一步深入揭示研究嗜水氣單胞菌與魚類的相互作用機制提供了支撐,為后續(xù)魴魚類細菌性敗血癥相關抗體的研制及魚類抗病品種選育奠定了前期理論研究基礎。

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DifferentialAeromonashydrophilaresistance mechanisms ofMegalobramaterminalisandMegalobramaamblycephalarevealed by quantification proteomics.

Journal of Zhejiang University (Agric. & Life Sci.)， 2015，41(5)：602-615

Fang Xianping1, Zhu Limin2, Liu Kai2, Ruan Songlin1, Xu Baoqing2, Xie Nan2, Cai Lijuan2, Liu Xinyi2, Dai Yulai2, Feng Xiaoyu2, Li Zhongquan2*

(1.InstituteofBiology,HangzhouAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310024,China; 2.InstituteofFisheriesResearch,HangzhouAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310024,China)

Bacterial sepsis is a serious infection for fish. In the past years, the feeding cost ofMegalobramaamblycephalahad been seriously affected by bacterial sepsis. However, bacterial sepsis does not extensively occur during the feeding processes ofMegalobramaterminalis. Therefore,M.terminaliswhich is highly resisted to bacterial sepsis is increasingly favored by farmers.

To study the pathogen resistance mechanism of different varieties ofMegalobramafish in response toAeromonashydrophila, we used label-free based proteomics technology to study the proteome change of the livers ofM.terminalisandM.amblycephalainfected withA.hydrophilaat 0 h, 3 h, 10 h and 24 h.

After identification and relative quantification, 49 and 29 proteins changed at different post-infection time points inM.terminalisandM.amblycephala, respectively. The differentially expressed proteins were deeply analyzed by gene ontology annotation and bioinformatics, and we found that, by comparing withM.amblycephala, the percentage of differentially expressed redox proteins inM.terminalisincreased from 7% to 13%, andβ-globin was up-regulated (1.66, 3.44 and 1.93 times increased at 3 time points). Furthermore, we found thatM.terminalismay specifically induce synergistic pathogen resistance mechanism including the regulation of pentose phosphate pathway, metabolism of fatty acids, leucine metabolism pathway and over-expression ofβ-globin to resist the invasion of pathogens.

In summary, we studied four different stages ofMegalobramaliver proteome expression afterA.hydrophilainfection, and found different pathogen resistance signal response pathway between two fish species, which indicates the resistance mechanism of different fish species afterA.hydrophilainfection. The result is of great benefit to further deeply reveal the molecular mechanisms of fish pathogen interactions and the breeding of pathogen-resistantMegalobramafish varieties.

Megalobramaterminalis;Megalobramaamblycephala;Aeromonashydrophila; quantification proteomics

國家大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術體系(CRS20144453)。

聯(lián)系方式：方獻平(http://orcid.org/0000-0001-7461-9170)，E-mail:fxpbio@163.com

2015-03-04;接受日期(Accepted)：2015-07-23；網(wǎng)絡出版日期(Published online)：2015-09-18

S 941

A

*通信作者(Corresponding author)：李忠全(http://orcid.org/0000-0002-4620-8750)，E-mail:hznkylzq@sina.com

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.s.20150918.1805.022.html