周麗娟，李桂萍，蔡士兵，巴青松

（1.淮北師范大學 生命科學學院，安徽 淮北 235000；2.安徽濉溪農業(yè)科研試驗站，安徽 濉溪 235100 ）

黑糯玉米含有豐富的天然黑色素，其黑色素具有很好的抗氧化、清除自由基、抗突變、抗腫瘤等生理功能，有很高的醫(yī)療保健價值.近年來，隨著人們生活水平和對健康要求的不斷提高，黑糯玉米備受消費者青睞［1-2］.

隨著分子生物學的發(fā)展，與其相關的實驗技術在黑糯玉米優(yōu)良種質篩選、遺傳多樣性的研究以及性狀改良等方面發(fā)揮越來越重要的作用，尤其對于黑糯玉米基因資源的挖掘與利用提供新的方法與手段［3-5］.在利用PCR方法對黑糯玉米資源遺傳多樣性進行分析和其他分子生物學研究時，黑糯玉米基因組DNA的提取方法是決定后續(xù)實驗能否成功的關鍵.目前，從玉米植物組織材料中提取DNA的方法通常有SDS法、CTAB法、改良CTAB法等多種不同的方法［6-8］.對于黑糯玉米不同部位的組織材料，由于其中所含的次生代謝產物不同，DNA的提取方法也不盡相同.本研究分別以黑糯玉米幼苗、種子和盾片為材料，采用CTAB法、SDS法和堿煮法分別對3種實驗材料進行基因組DNA的提取及DNA質量的檢測，以期通過比較分析獲得黑糯玉米理想的DNA提取方案，為進一步開展黑糯玉米的分子生物學研究提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料

黑糯玉米自交系種子由淮北市濉溪農科所提供.在光照培養(yǎng)箱發(fā)苗，取4葉期玉米幼苗的倒二葉用于葉片DNA提?。煌瑫r選取大小均勻的種子用于種子DNA提??；另外將種子的盾片用刀片分離下來用于DNA提取.

1.2 實驗方法

本研究用于黑糯玉米不同組織材料基因組DNA提取的方法有CTAB法［9］、SDS法［10］和堿煮法［11］，每種方法對每一種材料重復提取2次以上.

1.2.1 不同組織材料的處理

取黑糯玉米幼葉0.1 g放入用液氮預冷的研缽中，倒入足量的液氮迅速研磨至粉末狀，轉入預冷的離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆茫蝗闪Ｓ谜麴s水浸泡12 h左右的黑糯玉米種子，剝去種皮放入研缽中研磨至很細的粉末狀，后轉入離心管中保存?zhèn)溆茫?］；取干種子的盾片20粒放入研缽中研磨至粉末狀后轉入離心管中保存?zhèn)溆茫?2］.葉片、種子和盾片分別研磨8管，每種實驗方法所用組織材料的處理均相同.

1.2.2 DNA質量檢測

（1）瓊脂糖凝膠電泳檢測

取5 μL DNA樣品和3 μL 6×loading buffer 混勻，上樣于0.8%瓊脂糖凝膠，100 V電泳約40 min，在凝膠成像儀上觀察和拍照.

（2）紫外分光光度計檢測

取24 μL DNA 樣品用TE 稀釋至2.4 mL 用TE 做空白對照.在紫外分光光度計上測定OD260和OD280的值，重復4次.

1.3 數(shù)據處理

本研究所得數(shù)據均用spss20.0處理分析.

2 結果與分析

2.1 不同方法提取不同組織材料DNA形態(tài)比較

2.1.1 CTAB法

取4管裝有磨碎葉片離心管加入與樣品等體積65 ℃預熱的CTAB 提取液充分混勻后，放入65 ℃恒溫水浴鍋水浴50 min；取出離心管冷卻至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），混合搖勻放在搖床上振蕩40 min；抽提完成后于高速冷凍離心機按照8 000 r/min，4 ℃離心15 min；轉移上清液至新的離心管，加入約2倍體積-20 ℃預冷的無水乙醇，輕搖后即析出白色絮狀DNA沉淀.

從樣品種子和盾片的離心管取出的上清夜在加入二倍體積預冷的無水乙醇后析出的不是白色絮狀沉淀，而是整管都呈渾濁狀態(tài)，在-20 ℃沉淀30 min后全部沉到管底，但最終沒有抱團現(xiàn)象.

2.1.2 SDS法

用SDS法對3種不同材料提取DNA過程中DNA析出現(xiàn)象與CTAB法比較相似.從葉片提取的DNA呈白色絮狀沉淀，而從種子和盾片提取的DNA不容易抱團，呈松散狀.

2.1.3 堿煮法

取裝有種子和盾片的離心管，分別加入0.2 mol/L NaOH 后沸水浴15 min；待冷卻至室溫，加入0.5 mol/L Tris-HCL和TE8.0；后于高速冷凍離心機按照10 000 r/min，4 ℃離心15 min，轉移上清液至新的離心管，4 ℃保存用以后續(xù)檢測.

2.2 DNA樣品凝膠電泳檢測結果

圖1 不同方法提取的葉片基因組DNA電泳圖

圖2 不同方法提取的種子和盾片DNA電泳圖

對于用黑糯玉米不同組織材料提取的DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測.結果表明，用種子和盾片提取的DNA質量都比較差，電泳后只有微弱的主帶，有些甚至無主帶產生.而用葉片提取的基因組DNA質量較好，帶型清晰，亮度均一，DAN片段大小一致，無明顯拖尾現(xiàn)象（見圖1、2）.

對于用不同方法提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測.結果表明，用種子和盾片提取基因組DNA的方法中，堿煮法的效果最差，幾乎看不出條帶，CTAB法和SDS法效果也很不好，電泳檢測結果只有很微弱的主帶（圖2），說明要提取黑糯玉米基因組DNA，種子和盾片不是理想的提取材料.在用黑糯玉米苗期葉片提取基因組DNA 的兩種方法中，CTAB 法明顯好于SDS 法（圖1）.用CTAB 法提取的DNA 電泳檢測結果無明顯拖尾現(xiàn)象，亮度均一，DNA片段大小一致，RNA的污染低，且加樣孔內的亮度很低，說明蛋白質和酚類的污染很低；而用SDS法提取的DNA電泳檢測結果有個別主帶有輕微的拖尾現(xiàn)象，且RNA的污染也比CTAB 法明顯，且加樣孔內有明顯的亮度，說明DNA 樣品中有明顯的蛋白質和酚類物質的污染.

2.3 DNA樣品分光光度檢測結果

分別用CTAB 法、SDS 法和堿煮法提取的黑糯玉米種子和盾片的DNA 樣品經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，沒有提到或者僅僅提到微量的DNA，故不對以上兩種組織材料提取的DNA樣品進行紫外分光光度法檢測.只對用黑糯玉米幼嫩葉片提取的DNA進行紫外分光光度法檢測，結果見表1，將表1結果進一步處理得表2.

表1 CTAB法和SDS法提取黑糯玉米葉片基因組DNA的純度

表2 CTAB法和SDS法提取黑糯玉米基因組DNA的純度比較

從表1、表2可以看出，CTAB法提取的葉片DNA樣品的純度OD260/OD280在1.61～1.88之間，DNA樣品純度都較高，其均值為1.782 5，大于SDS法提取DNA的純度均值，且標準誤明顯比SDS的均值標準誤小，穩(wěn)定性較高.而 SDS 法提取的 DNA 樣品的純度 OD260/OD280 在 1.52～1.55 之間，有一管為 2.10，DNA樣品純度都較低，說明可能含有較多的酚類物質或者蛋白質，有一管含有較多的RNA.由此可以看出CTAB法提取的黑糯玉米葉片基因組DNA樣品純度較高、穩(wěn)定性好，此方法優(yōu)于SDS法.

3 討論

從本研究結果可以看到分別用3種不同方法進行黑糯玉米基因組DNA提取時，CTAB法提取的DNA質量最好.曾桂萍［13］等對快速提取普通玉米DNA方法的研究中發(fā)現(xiàn)采用普通玉米的盾片提取的DNA的濃度和質量明顯高于葉片DNA，本研究分別用黑糯玉米幼苗、種子和盾片3種不同材料提取黑糯玉米基因組DNA時，種子和盾片的提取效果均不如幼苗.推測原因是：與普通玉米相比，黑糯玉米種子（尤其是果種皮）中含有較多的花青素和多酚類物質，這些組分可能會影響DNA的提取效果；另外種子和盾片是成熟的組織材料，研磨不夠徹底導致后續(xù)提取過程中提取液較難溶解細胞膜，而健康的幼苗代謝產物少，細胞數(shù)量多，是比較理想的提取基因組DNA的組織材料.

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