楊 璐，蔡 寅，姚 帥，陳惠蘭，陳雨田，王 捷，羅先群，王新廣

(海南大學(xué)海南優(yōu)勢(shì)資源化工材料應(yīng)用技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 570228)

海南兩種江蘺不同提取物的抗菌活性

楊 璐，蔡 寅，姚 帥，陳惠蘭，陳雨田，王 捷，羅先群，王新廣

(海南大學(xué)海南優(yōu)勢(shì)資源化工材料應(yīng)用技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

以4種細(xì)菌，大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和4種真菌，白色念珠菌(Candida albicans)、番木瓜炭疽菌(Colletotrichum papayae P.Henn)、芒果炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果蒂腐菌(Dothiorella dominicana)作為供試菌，用圓形紙片法對(duì)海南2種江蘺(海南江蘺和細(xì)基江蘺)的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物進(jìn)行抗菌活性比較研究。結(jié)果表明:2種江蘺提取物均具有較為廣譜的抗菌能力，且不同提取物的抗菌活性物質(zhì)、抗菌活性和范圍不同，海南江蘺的抗菌效果優(yōu)于細(xì)基江蘺。

江蘺提取物;海南江蘺;細(xì)基江蘺;抗細(xì)菌;抗真菌

海洋與陸地的生境截然不同，使得海洋各種生物之間有著密切相關(guān)的生態(tài)關(guān)系，其中的生物活性物質(zhì)和化學(xué)防御機(jī)制起著重要作用。海藻是生長(zhǎng)在海洋中的低等隱花植物，也是海洋食物鏈的基礎(chǔ)。為了抵抗海洋生物的大量吞食、維護(hù)自身的生存繁衍，海藻大多能產(chǎn)生一些化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、伴有多種雜原子取代、生理活性獨(dú)特的化學(xué)防御物質(zhì)。對(duì)海藻天然活性物質(zhì)的研究正日益受到人們的關(guān)注，研究者已從海藻中分離提取出多種具有抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、細(xì)胞毒和拒食殺蟲(chóng)活性的天然活性物質(zhì)［1-5］。海藻中具有抗菌作用的化合物主要是脂類、酚類、倍半萜類、多糖類、鹵代化合物、含硫化合物、吲哚和甾體類等活性物質(zhì)［6-11］。由于一些人類病原菌對(duì)抗生素的耐藥性不斷增強(qiáng)，而海藻不同溶劑提取物能夠抑制許多食物腐敗菌及條件腐敗菌的生長(zhǎng)、對(duì)動(dòng)植物病原菌具有殺滅作用，因此，從海洋藻類的活性物質(zhì)中找尋結(jié)構(gòu)新穎、更具抗菌生物活性的新藥成為研究熱點(diǎn)。

江蘺為紅藻門 (Rhodophycophyta)、紅藻綱(Florideophyceae)、杉藻目 (Gigartinales)、江蘺科(Gracilariaceae)、江蘺屬(Gracilaria)海藻。海南江蘺枝條細(xì)小，是亞熱帶紅藻，主要產(chǎn)地是中國(guó)海南及越南;細(xì)基江蘺在我國(guó)主要分布于海南島，也是海南海藻栽培的主要產(chǎn)品，生長(zhǎng)快，產(chǎn)量高，發(fā)展?jié)摿Υ螅迫〉沫偰z被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生工業(yè)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極為顯著。鑒于目前國(guó)內(nèi)對(duì)細(xì)基江蘺抗真菌研究鮮有報(bào)道及海南江蘺抗真菌、抗細(xì)菌研究還未見(jiàn)報(bào)道，作者在此對(duì)海南2種江蘺的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物進(jìn)行抗菌活性比較研究，以期發(fā)現(xiàn)有生物活性的先導(dǎo)化合物，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用江蘺奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

海南江蘺(Gracilaria hainanensis)，采集于海南文昌;細(xì)基江蘺(Gracilaria tenuistipctata)，采集于海南?？?。

供試細(xì)菌:大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，均由海南大學(xué)生物工程系提供。

供試真菌:白色念珠菌(Candida albicans)、番木瓜炭疽菌(Colletotrichum papayae P.Henn)、芒果炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果蒂腐菌(Dothiorella dominicana)，均由海南大學(xué)生物工程系提供。

1.2 方法

1.2.1 江蘺提取物的制備及預(yù)處理

2種江蘺采集后，觀察藻體的形態(tài)學(xué)特征，并進(jìn)行物種鑒定。

挑除藻中雜物，清洗藻體表面鹽分，于45℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩，保存于干燥瓶中，備用。

取全藻粉末，用95%乙醇于50℃水浴提取3次，真空旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得乙醇粗提物浸膏。加10倍蒸餾水，攪拌，得到混懸液。按有機(jī)溶劑極性由小到大的順序依次進(jìn)行石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，獲得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物，分別真空旋轉(zhuǎn)蒸干。

將各溶劑提取物配成0.1 g·mL-1溶液進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 抗菌活性實(shí)驗(yàn)

采用圓形紙片法進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn):用接種環(huán)從已經(jīng)活化好了的菌種試管內(nèi)刮取一環(huán)菌于5 mL的無(wú)菌水中，充分振蕩搖勻后，得到菌懸液。取經(jīng)高壓濕熱滅菌過(guò)的圓形濾紙片(直徑為5 mm)浸漬于各提取物溶液中，兩片準(zhǔn)確重疊，待溶劑揮發(fā)后，貼于涂布細(xì)菌或真菌菌懸液的培養(yǎng)皿上，置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)(細(xì)菌37℃培養(yǎng)18～24 h;真菌28℃培養(yǎng)48～72 h)。測(cè)量抑菌圈直徑，同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗細(xì)菌活性比較研究

海南2種江蘺不同提取物的抗細(xì)菌活性見(jiàn)表1。

表1 海南2種江蘺不同提取物的抗細(xì)菌和抗真菌活性Tab.1 Antibacterial and antifungal activity of different extracts from two Hainan Gracilaria

由表1可看出:(1)海南2種江蘺不同提取物均具有較為廣譜的抗細(xì)菌能力，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抗菌作用。(2)細(xì)基江蘺的乙酸乙酯和正丁醇提取物對(duì)4種受試細(xì)菌均有抗菌作用，其中細(xì)基江蘺石油醚提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用最強(qiáng)。(3)海南江蘺的乙醇、石油醚、乙酸乙酯提取物對(duì)4種受試細(xì)菌均有抗菌作用，乙醇提取物的抑菌圈直徑最大，石油醚提取物次之，說(shuō)明海南江蘺乙醇提取物和石油醚提取物對(duì)受試細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)。(4)海南江蘺抗菌效果總體優(yōu)于細(xì)基江蘺。(5)細(xì)基江蘺乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌無(wú)抗菌活性，但經(jīng)過(guò)石油醚、乙酸乙酯萃取后，卻出現(xiàn)了抗金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的活性，這可能是由于乙醇提取物中多種成分共同起作用或者具有抗菌活性的功能基團(tuán)被其它化合物屏蔽了的緣故［6］。徐年軍等［12］曾報(bào)道通過(guò)薄層層析分離、刮取特征帶分析，可檢測(cè)到粗提物中被屏蔽的低活性組分?？梢?jiàn)，不同江蘺使用不同的有機(jī)溶劑提取得到的活性物質(zhì)及其抗菌能力是不同的。

2.2 抗真菌活性比較研究

海南2種江蘺不同提取物的抗真菌活性見(jiàn)表1。

由表1可看出:(1)2種江蘺不同提取物均具有較廣譜的抗真菌能力，但抗菌范圍與抗菌能力不同，海南江蘺的抗菌效果總體優(yōu)于細(xì)基江蘺。(2)2種江蘺乙醇提取物對(duì)同種供試真菌的抑菌圈直徑均最大，說(shuō)明2種江蘺乙醇提取物對(duì)受試真菌的抑制作用最明顯。

此外，海南江蘺石油醚提取物能使番木瓜炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)稀疏，但最外圍較為茂密;番木瓜炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)對(duì)海南江蘺乙醇提取物敏感并且受抑制后產(chǎn)生清晰的抑菌圈。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，海南江蘺乙醇提取物對(duì)番木瓜炭疽菌孢子的萌發(fā)有抑制作用。細(xì)基江蘺乙醇提取物、乙酸乙酯提取物對(duì)芒果炭疽菌有微弱的抑制活性，產(chǎn)生的抑菌圈不明顯。

2.3 討論

(1)海南2種江蘺一年四季均能生長(zhǎng)，但抗菌實(shí)驗(yàn)表明，抗菌活性最強(qiáng)的是夏季季風(fēng)期。這是因?yàn)?，江蘺在此季節(jié)可分泌相比于冬季更多的抗菌活性物質(zhì)。

(2)本實(shí)驗(yàn)是在體外的培養(yǎng)皿內(nèi)完成的，需要進(jìn)一步在活體實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。

(3)江蘺抗菌活性物質(zhì)種類繁多，不同的物質(zhì)有不同的抗菌能力和范圍。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)4種細(xì)菌和4種真菌進(jìn)行了抗菌活性研究，在抗菌活性物質(zhì)篩選中應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大篩選的靶目標(biāo)。

(4)本實(shí)驗(yàn)研究的是不同溶劑提取物的抗菌活性?？刹捎霉枘z柱層析、凝膠Sephadex LH-20柱層析、制備薄層層析和高效液相色譜等技術(shù)手段分離、純化海南2種江蘺化學(xué)成分，得到單體化合物，為抗菌活性研究奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以4種細(xì)菌和4種真菌作為供試菌，用圓形紙片法對(duì)海南2種江蘺(海南江蘺和細(xì)基江蘺)的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物進(jìn)行抗菌活性比較研究。結(jié)果表明:2種江蘺提取物均具有較為廣譜的抗菌能力，且不同提取物的抗菌活性物質(zhì)、抗菌能力和范圍不同，海南江蘺的抗菌效果優(yōu)于細(xì)基江蘺。為熱帶植物病原真菌和細(xì)菌病害的防治提供了新的參考。

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Antibacterial Activity of Different Extracts from Two Hainan Gracilaria

YANG Lu，CAIYin，YAO Shuai，CHEN Hui-lan，CHEN Yu-tian，WANG Jie，LUO Xian-qun，WANG Xin-guang
(Key Laboratory of Ministry of Education for Application Technology of Chemical Materials in Hainan Superior Resources，Hainan University，Haikou 570228，China)

Four kinds of bacterium(Escherichia coli，Staphylococcus aureus Rosenbach，Bacillus subtilis，Pseudomonas aeruginosa)and four kinds of fungus(Candida albicans，Colletotrichum papayae P.Henn，Colletotrichum gloeosporioides，Dothiorella dominicana)were used as the test bacteria，the antibacterial activities of extract of ethanol，petroleum ether，ethyl acetate，n-butanol from two Hainan Gracilaria(Gracilaria hainanensis，Gracilaria tenuistipctata)were studied by circular papermethod.Results showed that，two kinds of Gracilaria extract both had more broad-spectrum antibacterial activities，and antibacterial active substances，antibacterial activities and range of different extractwere different，the antibacterial efficiency of Gracilaria hainanensis was better than that of Gracilaria tenuistipctata.

Gracilaria extract;Gracilaria hainanensis;Gracilaria tenuistipctata;antibacterial;antifungal

Q 949.2 R 931.1

A

1672-5425(2015)02-0040-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.02.010

海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(213013)，2013年度中西部高校提升綜合實(shí)力工作資金“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”資助項(xiàng)目

2014-10-11

楊璐，女，云南昆明人;通訊作者:王新廣，副教授，研究方向:生物化工，E-mail:xg-wang@163.com。