付榮，吳清巖，徐紀香，緱夢帆，劉娟，同少峰，劉雪杰，郭輝，和俊杰

先天性腎病綜合征兒童的NPHS1基因突變分析

付榮，吳清巖，徐紀香，緱夢帆，劉娟，同少峰，劉雪杰，郭輝，和俊杰

目的分析先天性腎病綜合征(CNS)患兒的NPHS1基因突變及其特點。方法研究對象為1例中國中部地區(qū)漢族CNS患兒及其父母，對照人群為50例尿檢正常的漢族成年人。取所有研究對象外周靜脈血3ml，提取基因組DNA，PCR擴增NPHS1和NPHS2基因全部外顯子及其周圍的部分內含子序列，對PCR產物進行直接DNA序列測定。結果在CNS患兒中未檢出NPHS2基因突變，檢測出NPHS1基因的G928A(D310N)和IVS11+1 G>A 2個雜合突變?；純耗赣H尿檢正常，基因檢測顯示NPHS1的G928A(D310N)雜合突變，沒有IVS11+1 G>A雜合突變；患兒父親尿檢也正常，基因檢測顯示NPHS1的IVS11+1 G>A雜合突變，而沒有G928A(D310N)雜合突變。在50例對照人群中未發(fā)現NPHS1的G928A(D310N)和(或)IVS11+1 G>A突變。結論1例散發(fā)性CNS患兒中檢測到NPHS1基因的G928A(D310N)和IVS11+1 G>A 2個雜合突變，且IVS11+1 G>A為NPHS1基因剪接位點新突變。CNS患兒應進行NPHS1基因突變分析。

腎病綜合征；基因，NPHS1；突變

先天性腎病綜合征(congenital nephrotic syndrome，CNS)通常在出生后3個月內發(fā)病，臨床表現為腎病綜合征或大量蛋白尿[1]。CNS具有遺傳異質性，大部分患兒起病早、病情重，對糖皮質激素耐藥，腎功能呈進行性減退，預后極差；但也有部分患兒臨床癥狀較輕。近年來研究表明，大部分CNS是由于編碼腎小球濾過屏障蛋白的基因突變所致，如NPHS1和NPHS2等[2-7]。NPHS1定位于人類染色體19q13.1，是先天性芬蘭型腎病(congenital nephrotic syndrome，Finnish type，CNF)的致病基因[1]，其編碼的蛋白nephrin是第一個被定位于腎小球足細胞裂孔隔膜(SD)上的分子，已被證實是維持腎小球正常濾過功能的關鍵分子之一。NPHS1基因突變在芬蘭CNS兒童中檢出率約為98%，在芬蘭以外地區(qū)的CNS患兒中檢出率為39%～80%。國外的研究表明，NPHS1基因突變是CNS較常見的原因，其基因型與表型的關系也成為目前的研究熱點之一[2]。目前我國對CNS患者致病基因及其突變的研究還很少。本研究采用聚合酶鏈反應(PCR)和DNA直接測序的方法，對1例中國中部地區(qū)漢族散發(fā)性CNS患兒進行NPHS1基因分析，通過復習國內外研究結果，分析其基因型與表型之間的關系，旨在探討和研究CNS的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒，男，2個月17d。第1胎，第1產，足月順產，胎盤不詳，出生體重2.5kg，生后無窒息。生后20d出現腹脹，診斷為先天性巨結腸。到另一家醫(yī)院就診時發(fā)現患兒水腫，查尿常規(guī)示蛋白(未做蛋白定量)。入院前2周出現發(fā)作性抽搐，水腫逐漸加重，為進一步診治來我院，擬診“腎病綜合征(先天性)”，收住入院治療。入院體檢：體重4000g，呼吸平穩(wěn)，面部及四肢輕至中度水腫，心肺聽診正常，腹部膨隆，肝臟右肋下可觸及2cm，脾臟肋下未觸及，神經系統未見異常。尿常規(guī)：尿蛋白，24h尿蛋白定量因留取標本困難未查；血生化：總蛋白16.9g/L，白蛋白10.9g/ L，尿素氮1.16mmol/L，肌酐22.1μmol/L，總膽固醇6.66mmol/L；抗巨細胞抗體、弓形蟲抗體、風疹病毒抗體、單純皰疹病毒抗體、支原體抗體、衣原體抗體、梅毒抗體及人免疫缺陷病毒抗體均陰性；甲、乙和丙型肝炎病毒抗體均陰性；甲狀腺功能檢查正常；血液串聯質譜未提示明顯異常，尿有機酸測定未見異常。心臟彩超心內結果正常。腎臟彩超示：左腎58mm×34mm，右腎59mm×35mm，回聲增強。診斷為先天性腎病(CNS)。因家長不同意，未做腎穿刺活檢。未用激素治療，僅給予對癥及口服卡托普利治療。出院后隨訪至目前，患兒身高85cm，體重13kg，尿蛋白，腎功能正常。

患兒父親24歲，母親24歲，均身體健康，尿常規(guī)正常，家族中其他成員均無腎臟病史。以50例尿檢正常的漢族成年志愿者作為對照人群，男39例，女11例，年齡18～23歲。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA的提取 在獲得倫理委員會批準和征得患兒父母及對照人群知情同意后，采集上述研究對象的外周血標本，應用EZNATM SE Blood DNA試劑盒(美國Omega公司)抽提基因組DNA。

1.2.2 基因突變分析 采用文獻報道[8-9]的引物序列和實驗條件，PCR分別擴增NPHS1和NPHS2基因全部外顯子及其周圍的部分內含子。引物由上海生工生物技術有限責任公司合成。PCR產物直接測序：以正、反向引物為測序引物，應用Perkin-Elmer公司的ABI377測序儀(上海生工生物工程技術有限公司)進行DNA序列測定。對測序異常的片段重新進行PCR擴增，再次正向、反向測序，以驗證結果的可靠性。

1.2.3 突變序列的命名 根據從NCBI的Nucleotide數據庫中獲得的NPHS1基因組序列(GeneBank：NT_011109.16)、mRNA序列(GeneBank：N M_0 0 4 6 4 6)、蛋白質序列(G e n e B a n k：NP_004637)和人類DNA序列變異命名建議命名為NPHS1基因突變。

1.2.4 突變位點查新 跟蹤檢索NCBI所屬的PubMed文獻數據庫、單核苷酸多態(tài)性(simple nucleotide polymorphism，SNP)數據庫(SNP database，dbSNP)公布的NPHS1基因變異，將本研究中經DNA測序證實的基因變異與上述變異進行比較，以確定其是否為新發(fā)現的NPHS1基因變異。

2 結 果

2.1 PCR反應擴增結果 以相應的引物進行的NPHS1基因和NPHS2基因PCR擴增都有較好的擴增結果，擴增片段與所設計的大小一致，無非特異性擴增條帶。因此，可以進行純化和測序。

2.2 PCR產物直接測序結果 患兒NPHS2基因的外顯子及其周圍的內含子均未發(fā)現突變。在患兒NPHS1基因的第8外顯子發(fā)現一雜合突變G928A，遺傳密碼子由GAC變?yōu)锳AC，該突變導致310位的天冬氨酸被天冬酰胺替代(Asp310Asn，D310N)?；純耗赣HNPHS1基因的第8外顯子也存在同一突變，而其父的NPHS1基因的第8外顯子測序結果與野生型相同。同時檢測到患兒NPHS1基因的第11內含子5'+1剪接位置的鳥嘌呤變?yōu)橄汆堰?IVS11+1 G>A)的雜合突變(圖1)?；純焊赣HNPHS1基因的第11內含子也存在同一突變，而其母的NPHS1基因的第11內含子測序結果與野生型相同。在50例對照人群中未發(fā)現NPHS1的G928A(D310N)突變，也未發(fā)現IVS11+1 G>A突變。

3 討 論

國外研究認為大部分CNS是由于編碼腎小球裂孔隔膜關鍵蛋白的基因突變所致，較常見的是編碼nephrin蛋白的NPHS1基因突變，但國內對CNS的致病基因研究不多。本研究患兒于生后3個月內出現腎病綜合征，臨床符合CNS的診斷。我們的檢測結果證實了中國中部地區(qū)散發(fā)性CNS也存在NPHS1基因突變。近年來有報道CNS還可由NPHS2基因突變所致[3]，但本研究對先證者進行的NPHS2的全部8個外顯子測序結果顯示正常，未見突變，且50例健康人中也未檢出以上基因突變，因此，我們認為本研究中的2個NPHS1基因的雜合突變是CNS患兒的致病突變。經檢索人類基因突變數據庫(HGMD)和最新的文獻，未見IVS11+1 G>A雜合突變的相關報道，而G928A錯義突變?yōu)槲覈褕蟮赖腘PHS1基因突變[8,10]。

本研究發(fā)現的CNS患兒NPHS1基因2個雜合突變中，一個為剪接位點突變(IVS11+1G>A)，位于11內含子5'端剪接給位區(qū)域。突變引起異常剪接的方式主要有5種形式：剪接位點外顯子(突變臨近的)刪除、潛在的剪接位點激活、內含子滯留、新剪接位點的產生及外顯子剪接增強子的破壞。證實該突變具體導致哪種異常剪接方式需要取腎組織提取mRNA來確定，目前患兒家長拒絕行腎穿刺術，暫時不能進行進一步的研究。另一個為錯義突變(G928A)，導致310位的天冬氨酸被天冬酰胺替代(Asp310Asn)，由NPHS1基因的此位點導致的突變發(fā)生CNS已有報道[8,10]。將患兒及其父母的NPHS1突變進行比較分析顯示：第11內含子剪接突變(IVS11+1G>A)來自患兒父親，第8外顯子的錯義突變(G928A)來自患兒母親?；純焊改笧镹PHS1基因突變的攜帶者。

此外，本研究還發(fā)現患兒存在5種NPHS1基因堿基變異：E117K(rs3814995)、S1105S (rs2071327)、IVS8+68A>G、IVS24+36C>T和IVS27+45C>T，經與NCBI和Ensembl的SNP數據庫比較，并檢索相關文獻[8,11]，證實這5個變異均為單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。

圖1 新發(fā)現的CNS患兒NPHS1基因剪接位點突變測序圖Fig.1 Novel splice site mutations IVS11+1G>A of the NPHS1 gene were identified by sequencing a Chinese child with congenital nephrotic syndromeChromatogram by sequencing of exon 11 of NPHS1. P. Child of CNS; F. Father of patient; M. Mother of patient; The upper:normal sequence; The lower:variation sequence; The arrows indicate mutant positions

Nephrin含有1241個氨基酸，由1個跨膜區(qū)(第1056-1241位氨基酸)和長的細胞外區(qū)域(第1-1055位氨基酸)組成，細胞外區(qū)域含有8個免疫球蛋白樣基序及1個纖維連接蛋白樣基序。根據NPHS1編碼的分子結構，我們進一步分析了本研究所檢測到的突變意義：錯義突變(G928A)導致310位的天冬氨酸被天冬酰胺替代(Asp310Asn)發(fā)生在nephrin的Ig3基序(motif)，而剪接位點突變(IVS11+1G>A)導致的異常剪接發(fā)生于nephrin的Ig5基序，可見2個雜合突變均影響nephrin的功能結構域(Ig樣基序)。復習國內外研究結果，我們認為不同的突變部位、突變類型可能出現不同的臨床表型。研究者曾報道臨床表型較輕的CNS，其NPHS1基因突變位于nephrin分子的Ig1、Ig3、Ig5和Ig6基序，而臨床表型較重的CNS的NPHS1突變多位于nephrin分子的Ig2、Ig4和Ig7基序[8]。造成CNS臨床表現和預后不同的分子機制可能是某些NPHS1位點突變導致其編碼的分子停留在內質網，不能回到足細胞膜的表面參與裂孔隔膜(SD)形成，從而出現嚴重的臨床表現；而另一些NPHS1位點突變導致其編碼的分子部分停留在內質網，尚有部分分子回到足細胞膜的表面參與SD形成，出現輕、中度的臨床表現，輕、中度臨床表現主要取決于回到足細胞表面參與SD形成的分子多少。而在本例患兒檢測到位于NPHS1基因Ig3和Ig5基序2個雜合突變，理論上推測可能為較輕突變，我們的隨訪也提示，截止投稿時，該患兒已2歲10個月，腎功能尚正常，智力水平基本等同于同齡兒童，但身高及體重較同齡兒童明顯降低，臨床表型較輕。提示不同結構域對于nephrin分子的功能，以至發(fā)生突變后對于臨床表型的影響可能不同，因此分析并確定CNS基因突變性質和位置有望指導臨床客觀地判斷預后。

國內已有4家醫(yī)院對家族性和散發(fā)性CNS進行相關基因突變分析。石巖等[8]于2005年率先在1個中國CNS家系中檢測出了NPHS1基因3個雜合突變，其中1個為缺失突變(1893-1900del8)，另外2個為錯義突變(G928A和G2869C)，證實中國CNS家系中存在NPHS1基因突變。隨后，王道靜等[11]在1例中國南方漢族散發(fā)性CNS患兒中檢測到NPHS1基因純合插入突變(3250insG)；李國民等[12]在2例CNS患兒中檢測到NPHS1基因突變：1例患兒為C3325T錯義突變(R1109X，Fin-minor)和IVS26-2A>T雜合突變，1例患兒為C3325T錯義突變(R1109X，Finminor)和C3478T錯義雜合突變；米榮等[10]在1例CNS患兒中檢測到NPHS1基因2個雜合突變(G928A 和IVS18+5G>A)，合并巨細胞病毒(CMV)感染，病情較重。本研究發(fā)現了1例CNS患兒存在NPHS1基因突變，即G928A和IVS11+1G>A的復合雜合突變，IVS11+1G>A既往未見文獻報道。國內尚未發(fā)現有CNS患兒存在其他基因突變的報道。NPHS1基因是否是中國CNS患兒的主要致病基因，仍需要更多的病例來證實。臨床上對于CNS患兒可以先做NPHS1基因突變分析。通過復習國內相關文獻，發(fā)現在3例來自中部地區(qū)的CNS患兒均檢測到NPHS1基因G928A錯義突變，該突變是不是中國中部地區(qū)漢族CNS的NPHS1基因的熱點突變，仍有待于更多的研究來證實。

致謝 感謝南京軍區(qū)福州總醫(yī)院兒科陳新民、余自華教授和實驗科蘭風華、王水良教授在本課題設計及實驗方面給予的幫助和指導！

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Mutation of NPHS1 gene in a Chinese child with congenital nephrotic syndrome

FU Rong, WU Qing-yan, XU Ji-xiang, GOU Meng-fan, LIU Juan, TONG Shao-feng, LIU Xue-jie, GUO Hui, HE Jun-jie
Department of Pediatrics, Puyang Oilfield General Hospital, Puyang, Henan 457001, China

ObjectiveTo analyze the mutations and characteristics of NPHS1 and NPHS2 genes in a child with congenital nephrotic syndrome (CNS).MethodsMutation analysis was made for all exons and exon/intron boundaries of NPHS1 and NPHS2 genes in a child and his parents as well as 50 unrelated adults with normal urine test results as control using PCR and direct sequencing techniques.ResultsNo mutation of NPHS2 gene was detected, while a novel splice site mutation of IVS11+1G>A within intron 11 and a missense mutation within exon 8 (c.928G>A) in NPHS1 gene were detected in the child with CNS. Urinalysis was normal in child's mother, and it was found that c.928G>A (D310N) but no IVS11+1G>A heterozygous mutation, and his father was shown to have a normal urinalysis results, and the result of gene examination was IVS11+1G>A, but without c.928G>A (D310N) heterozygous mutation. All these IVS11+1 G>A and c.928G>A (D310N) mutations were not found in the 50 unrelated controls.ConclusionsTwo heterozygote mutations IVS11+1 G>A and c.928G>A in the NPHS1 gene have been identified in a child with CNS in the central region of China. The splice site mutation of IVS11+1 G>A is an novel genetic defect of CNS. It is necessary to look for mutations in NPHS1 gene in the children with CNS.

nephrotic syndrome; genes NPHS1; mutation

R692

A

0577-7402(2015)07-0578-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.13

2014-12-06；

2015-04-08)

(責任編輯：張小利)

付榮，副主任醫(yī)師，博士研究生。主要從事小兒腎臟疾病的基礎與臨床研究

457001 河南濮陽 河南省濮陽市油田總醫(yī)院兒科(付榮、吳清巖、徐紀香、緱夢帆、劉娟、同少峰、劉雪杰、郭輝、和俊杰)