劉壘，張洪義，胡深，常鵬，史斌，李文兵

·軍事醫(yī)學·

模擬航空正加速度(+10Gz)暴露下大鼠肝臟組織中NF-κB的表達及其意義

劉壘，張洪義，胡深，常鵬，史斌，李文兵

目的探討模擬航空正加速度(+10Gz)暴露下大鼠肝組織中NF-κB的表達情況及其意義。方法健康成年雄性SD大鼠24只，隨機均分為對照組及實驗A、B、C組，后3組分別在+10Gz加速度下驗離心作用0.5、24、48h。實驗結(jié)束后采血檢測血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平；取大鼠肝組織，采用Western blotting和免疫組化染色檢測NF-κB的表達。結(jié)果離心作用結(jié)束后，與對照組相比，A組大鼠毛發(fā)蓬亂，不進食水，靜臥不動；B組大鼠毛發(fā)散亂，稍進食水，活動量減少；C組大鼠毛發(fā)順暢但少光澤，已正常進食水，四處活動。與對照組相比，B組ALT、AST水平均升高，且B組高于A組和C組(P<0.05)，A組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western blotting和免疫組化染色結(jié)果顯示，A、B、C組大鼠肝組織NF-κB表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)，且B組明顯高于A組和C組(P<0.05)，A組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。免疫組化切片顯示，肝組織內(nèi)NF-κB陽性產(chǎn)物主要位于肝細胞內(nèi)，亦可見于炎癥細胞及Kupffer細胞內(nèi)，可分為胞質(zhì)型、核型、核漿型等三個類型，單獨或混合存在。結(jié)論模擬航空正加速度(+10Gz)暴露下大鼠肝組織中NF-κB表達水平明顯增高，可能與加速度引起的肝臟應激損傷有關。

加速度；肝損傷；NF-κB；免疫組織化學；印跡法，蛋白質(zhì)

隨著航空和軍事技術的發(fā)展，飛行員經(jīng)常、反復地暴露于正加速度(+Gz)環(huán)境中，身體各器官系統(tǒng)會產(chǎn)生一定的應激反應。目前國內(nèi)外關于+Gz對腦、心、腎等重要器官影響的研究較多[1-2]，如重復持續(xù)+Gz對大鼠心臟和大腦的影響已得到證實[3-4]，但其對肝臟影響的病理生理研究較少。近年來，我國航空事業(yè)迅猛發(fā)展，飛行員特殊訓練和高性能戰(zhàn)斗機的使用對航空醫(yī)學提出了新的要求。本研究通過離心機實驗模擬重復持續(xù)性正加速度(+10Gz)對大鼠肝臟的影響，觀察高+Gz下肝臟細胞的損傷情況及肝組織中NF-κB含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康成年雄性Wistar大鼠24只，體重195～215g(由軍事醫(yī)學科學院動物中心提供，合格證號SCKK-2012-C004)。NF-κBp65 mAb、牛血清白蛋白(Sigma公司，美國)，DAB顯色劑(ZSGBBIO公司，北京)，預染的蛋白標記物(Thermo公司)，β-actin單克隆抗體、羊抗兔二抗(中杉公司，北京)，蛋白提取混合劑(凱基公司，中國)；BCA蛋白測定試劑盒(索萊寶公司，中國)；Tris堿、甘氨酸(AMRESCO公司，美國)，光學顯微鏡(Olympus BX51，日本)，圖像分析系統(tǒng)(CMIAS，空軍總醫(yī)院)；PVDF膜、瓊脂糖水平電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，美國)，低溫離心機5810R、微型高速離心機(Eppendorf，Hamburg，德國)，Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)(天能科技公司，上海)。

1.2 分組 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗，隨機分為對照組、實驗A組、實驗B組、實驗C組，每組6只。實驗A、B、C組分別采用+10Gz離心作用0.5、24h和48h。

1.3 造模與取材 參照有關加速度暴露方法建立模型[5]，各實驗組離心作用結(jié)束后，大鼠采用10%水合氯醛(0.5ml/100g)腹腔注射麻醉，無菌條件下經(jīng)腹正中線開腹，下腔靜脈采血，迅速切取肝臟標本，每只動物肝臟切割保存5塊大小約為1cm×1cm×1cm的組織，切割部位隨機選取，使用生理鹽水沖洗肝組織上殘留的血液，用10%甲醛固定；其余部分迅速液氮冷凍保存。對照組實驗保存標本方法同實驗組。

1.4 血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST水平測定 大鼠麻醉后常規(guī)從肝下下腔靜脈采血4ml，用全自動生化分析儀檢測血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。

1.5 免疫組化檢測大鼠肝組織NF-κB的表達 肝組織常規(guī)石蠟包埋，每塊標本隨機連續(xù)切片5張，厚度5μm，采用ABC法進行免疫組化，主要過程包括：H2O2/甲醛封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常綿羊血清封閉，胰蛋白酶消化，PBS漂洗5min×3次。滴加一抗NF-κB(1:100)，4℃冰箱孵育過夜，0.01mol/L PBS洗5min×3次，加生物素化二抗和ABC復合物，37℃孵育30min，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

NF-κB陽性表達判定：以細胞核和(或)胞質(zhì)中有明顯的棕黃色顆粒為陽性。在光學顯微鏡下觀察整張切片的表達情況，每張切片隨機選取5個陽性染色區(qū)域(400倍視野)，計數(shù)陽性細胞，并采用CMIAS病理分析系統(tǒng)測定平均吸光度(MOD)、積分吸光度(IOD)和平均灰度值(AGQ)，每個標本取5個視野的平均值進行定量分析。陽性細胞越多，各值越大，表示免疫反應越強。

1.6 Western blotting檢測大鼠肝組織NF-κB蛋白的表達 秤取肝臟組織塊100mg，在液氮中充分研磨，移入玻璃勻漿器，加入蛋白提取混合劑1.5ml，充分勻漿后冰浴下超聲處理，4℃下13 000r/min離心10min，取上清，加樣，160V電泳1h；電泳完畢后切取60～94kD和27～45kD區(qū)，轉(zhuǎn)膜液浸泡20min，轉(zhuǎn)膜(100V，100min)；在水平搖床上用TBST浸泡PVDF膜10min，室溫下脫色，搖床上搖動封閉1～3h，用TBS稀釋一抗(NF-κB 1:200，GAPDH 1:10 000)，與PVDF膜一起在4℃條件下?lián)u動孵化過夜，然后用TBST在脫色搖床上洗10min×3次，加堿性磷酸酶標記的二抗(TBS稀釋)，與PVDF膜在常溫下育孵2～3h，在脫色搖床上用TBST洗10min×3次，然后用堿性磷酸酶底物BCIP/NBT顯色10min。采用Quantity One v4.6.2軟件進行吸光度值分析，結(jié)果以目的蛋白條帶與對應β-actin(內(nèi)參照)條帶吸光度的比值表示。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，多組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物基本情況 各組動物在實驗期間均無死亡。實驗期間，觀察到大鼠毛發(fā)散亂，失去光澤，急躁不安，暫不進食，精神較差，但隨著時間延長，實驗組大鼠都逐漸恢復至正常飲食和活動。

2.2 血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST水平 與對照組相比，實驗各組ALT、AST水平均升高，且實驗A組和C組低于實驗B組(P<0.05)，但A組與C組相比差異無統(tǒng)計學意(P>0.05，表1)。

2.3 免疫組化染色結(jié)果分析 實驗組大鼠肝細胞內(nèi)可見NF-κB蛋白陽性表達，呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞核、細胞質(zhì)中，分布不均，呈單個散在或小片狀分布，可分為胞質(zhì)型、核型、核漿型等三個類型，單獨或混合存在，而對照組僅見少量顆粒狀陽性表達。在實驗組肝細胞核型陽性表達的切片中，可見全核陽性者，也可見局部碎點狀陽性者，且主要位于核仁區(qū)(圖1)。CMIAS病理分析系統(tǒng)定量分析結(jié)果顯示，實驗各組的MOD值均高于對照組，且實驗B組高于實驗A組和實驗C組(P<0.05)，但實驗A組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表1 各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT比較(U/L，±s，n=6) Tab. 1 Comparison of serum ALT and AST levels in different groups (U/L,±s,n=6)

表1 各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT比較(U/L，±s，n=6) Tab. 1 Comparison of serum ALT and AST levels in different groups (U/L,±s,n=6)

(1)P<0.05 compared with control group; (2)P<0.05 compared with group A; (3)P<0.05 compared with group B

64±3(1)(2) 216±30(1)(2)C 44±4(3) 123±31(3)Group ALT AST Control 32±6 126±40 A 48±5 135±22 B

圖1 加速度對大鼠肝臟NF-κB表達的影響(免疫組化 ×400)Fig. 1 Impact of acceleration on NF-κB expression in rat liver (Immunohistochemistry ×400)A. Control group; B. NF-κB expression, nuclear plasma type; C. Hepatocyte nuclear expression of NF-κB, showing full and partial broken punctate positive, mainly in the nucleolus area; D. NF-κB positive products can also be found within inflammatory cells and Kupffer cells

表2 各組大鼠肝細胞內(nèi)NF-κB表達的免疫組化定量分析(±s，n=6)Tab. 2 Quantitative analysis of NF-κB expression in rat liver determined by immunohistochemical assay (±s,n=6)

表2 各組大鼠肝細胞內(nèi)NF-κB表達的免疫組化定量分析(±s，n=6)Tab. 2 Quantitative analysis of NF-κB expression in rat liver determined by immunohistochemical assay (±s,n=6)

AOD. Average optical density, IOD. Integrated optical density, AGQ. Average gray of quantitative analysis. (1)P<0.05 compared with control group; (2)P<0.05 compared with group A; (3)P<0.05 compared with group B

Group AOD IOD AGQ Control 0.11±0.01 4.85±0.08 45.76±1.46 A 0.26±0.02(1) 11.24±0.41(1) 91.50±1.15(1)B 0.34±0.01(1)(2) 15.960±0.58(1)(2) 110.26±1.11(1)(2)C 0.12±0.03(1)(3) 5.56±0.39(1)(3) 47.10±1.40(1)(3)

2.4 Western blotting結(jié)果分析 與對照組相比，實驗A、B組肝組織NF-κB蛋白表達均明顯增高(P<0.05)，且實驗B組明顯高于實驗A組和C組(P<0.05)，實驗A組與C組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織NF-κB蛋白表達水平比較(Western blotting)Fig. 2 Expression of NF-κB protein in liver of different groups (Western blotting)(1)P<0.05 compared with control group; (2)P<0.05 compared with group A

3 討 論

NF-κB于1996年首先報道為B淋巴細胞核抽取物中檢出的可與免疫球蛋白輕鏈基因增強子κB序列特異結(jié)合的核蛋白因子[6]。從蛋白家族分類可知，NF-κB屬于Rel蛋白家族，是二聚體蛋白分子，包含多種亞單位結(jié)構，其中NF-κB p56是目前研究較為清楚的一員，表達廣泛，生物活性強，易于檢測。NF-κB可介導多種炎性介質(zhì)和急性期反應蛋白的表達，參與細胞凋亡的調(diào)控。在正常的真核細胞中，NF-κB通常與IκB抑制蛋白形成穩(wěn)定的復合物，處于失活狀態(tài)；當多種異常因素如高壓、低氧、強射線、高溫、低溫等作用于細胞后，NF-κB可被激活，從而啟動和調(diào)控轉(zhuǎn)錄程序，發(fā)揮相應的生物學效應[6-8]。

據(jù)報道，NF-κB參與肝臟多種病變的調(diào)控，當肝臟受到急性損傷后，該蛋白可發(fā)揮重要的生物活性作用[9]。Salazar-Montes等[10]報道肝臟急性損傷30min后NF-κB即被激活，這與本實驗的結(jié)果相似。有研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性或炎癥性肝損傷后，NF-κB活性可出現(xiàn)明顯升高，且這種升高與肝功能的變化呈正相關[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可通過調(diào)控其下游基因的結(jié)構而間接加重肝臟損傷[11-12]。

現(xiàn)代高性能戰(zhàn)斗機在飛行中產(chǎn)生的加速度可高達+9Gz以上，其持續(xù)時間可達15～45s，超出了人體正常的耐受限度。由于+Gz暴露導致血液向下端肢體和胃腸道分布，回心血量減少，因此有學者推測其可導致肝動脈和門靜脈向肝臟和膽道系統(tǒng)的供血明顯減少，通過誘導肝臟內(nèi)微循環(huán)損害導致肝膽系統(tǒng)繼發(fā)性損傷。在+Gz重復暴露下，大鼠肝臟超氧化物歧化酶(SOD)含量明顯降低，導致肝臟氧自由基代謝能力下降。另有研究顯示，在持續(xù)性+Gz暴露下，大鼠肝臟糖異生增加，從而可適應不同G值的作用[13]。

本研究通過Western blotting半定量檢測和免疫組化染色證實，在模擬航空加速度作用后早期(24h 內(nèi))，大鼠肝臟組織中NF-κB表達水平明顯升高，考慮與離心加速度造成的肝臟分子水平的應激反應有關。本研究還發(fā)現(xiàn)離心過程中大鼠毛發(fā)散亂，失去光澤，急躁不安，暫不進食，精神較差，但隨著時間延長(24～48h后)，實驗組大鼠逐漸恢復至正常飲食和活動。這一現(xiàn)象與肝組織中NF-κB表達先升后降的結(jié)果一致，提示肝臟NF-κB表達改變在離心后效應中具有一定意義。

總之，在加速度應激環(huán)境下，血液再分布以及器官擠壓造成的肝臟急性應激損傷，NF-κB發(fā)揮著參與細胞的凋亡作用，但具體機制需待進一步研究。

[1]Zhang L, Luo HL, Liu XD. Effect of exposure to positive acceleration (+Gz) on the expression of TNF-α and ICAM-1 in swine with coronary artery stenosis[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(6):498-502. [張泠, 羅惠蘭, 劉興德. 正加速度暴露對冠狀動脈狹窄小型豬模型TNF-α和ICAM-1表達的影響[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2014, 39(6):498-502.]

[2]Wang L, Duan Mu LJ, Jiao L,et al. Changes in myocardial action potential of rabbit with myocardial ischemia exposed to repeated positive acceleration (+Gz)[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(7):581-585.[王蘭, 端木魯健, 焦琳, 等. 反復正加速度暴露致兔缺血心肌動作電位變化的研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2014, 39(7):581-585.]

[3]Hu S, Zhang HY, Zhao G,et al. The increasing expression of GRP78 in rats liver cells after different repeat and sustained +Gz exposure[J]. Basic Clin Med, 2015, 35(1):17-21.[胡深, 張洪義, 趙剛, 等. 不同+Gz重復持續(xù)暴露對大鼠肝臟組織損傷及GRP78的表達影響[J].基礎醫(yī)學與臨床, 2015, 35(1):17-21.]

[4]Zawadzka-Bartczak EK, Kopka LH. Centrifuge braking effects on cardiac arrhythmias occurring at high +Gz acceleration[J]. Aviat Space Environ Med, 2004, 75(5):458-460.

[5]Guillaume AI, Osmont D, Gaffié D,et al. Physiological implications of mechanical effects of +Gz accelerations on brain structures[J]. Aviat Space Environ Med, 2002, 73(3):171-177.

[6]Sen R, Baltimore D. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-bin- ding protein Nf-kappa B by a posttranslational mechanism[J]. Cell, 1986, 47(6):921-928.

[7]Leeman JR, Gilmore TD. Alternative splicing in the NF-kappaB signaling pathway[J]. Gene, 2008, 423(2):97-107.

[8]Su JD, Wu LF. Relationship between nuclear factor-kappa B and cell apoptosis[J]. World Chin J Dig, 2007, 15(12):1411-1416.[蘇劍東, 吳靈飛. NF-kappaB與細胞凋亡[J]. 世界華人消化雜志, 2007, 15(12):1411-1416.]

[9]Czaja MJ. Cell signaling in oxidative stress-induced liver injury[J]. Semin Liver Dis, 2007, 27(4):378-389.

[10]Salazar-Montes A, Ruiz-Corro L, Sandoval-Rodriguez A,et al. Increased DNA binding activity of NF-kappaB, STAT-3, SMAD3 and AP-1 in acutely damaged live[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(37):5995-6001.

[11]Yang WJ, Yu ZP, Zhang QY,et al. Changes of DNA binding activity of nuclear factor κappaB and its significance in liver damage after traumatic inflammation[J]. J Hepatopancreatobil Surg, 2006, 18(1):13-15.[楊文軍, 余正平, 張啟瑜, 等. 核因子-κB活性在創(chuàng)傷性炎癥大鼠肝臟損傷中的變化及其意義[J]. 肝膽胰外科雜志, 2006, 18(1):13-15.]

[12]Wang CY, Fan YQ, Chi BR,et al. Roles of nuclear factor-kappa B, tumor necrosis factor-α and Bcl-2 in acute hepatic injury and their mechanisms[J]. World Chin J Dig, 2008, 16(25):2804-2808. [王春妍, 范玉強, 遲寶榮, 等. 核因子-kappa B及其下游因子TNF-alpha、Bcl-2在急性肝損傷中的作用及機制[J]. 世界華人消化雜志, 2008, 16(25):2804-2808.]

[13]Daligcon BC, Oyama J, Hannak K. Increased gluconeogenesis in rats exposed to hyper-G stress[J]. Life Sci, 1985, 37(3):235-241.

Expression of nuclear factor-kappa B in hepatic tissue and its significance in rats after repeated and sustained +10Gz exposure

LIU Lei, ZHANG Hong-yi*, HU Shen, CHANG Peng, SHI Bin, LI Wen-bing
Department of Hepatobiliary Surgery, Air Force General Hospital, Beijing 100142, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: zhhyiyi1487@163.com

, E-mail: zhhyiyi1487@163.com
This work was supported by the “Twelfth Five-Year Plan” Medical Science and Technology Research Project of PLA (CKJ12J022)

ObjectiveTo observe the injury to liver cells, and to investigate the changes in nuclear factor-kappa B (NF-κB) in the liver tissue after exposure to positive ten acceleration (+10Gz).MethodsTwenty-four adult male Wistar rats were randomly assigned to four groups:blank control, exposure groups A, B, and C. The rats of three exposure groups were subjected to centrifugal force of +10Gz for 0.5, 24, and 48h respectively, which was carried out in an Air Force Institute of Aviation Medicine. Plasma aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were determined. Liver tissue was harvested for immunohistochemistry, and Western blotting was performed for expression of NF-κB.ResultsAfter +10 Gz exposure, rats of the group A showed shaggy hair, apathetic to food, and laid still, while group B rats showed shaggy hair, took a little food with lowering of activity level. The rats in group C showed normal activities. Both the levels of serum AST and ALT were elevated, and they were higher in group B than that of groups A and C (P<0.05), however, there was no statistically significant difference between groups A and C (P>0.05). Western blotting and immunohistochemical staining showed that the NF-κB expression levels were significantly higher in exposure groups than in control group (P<0.05), and significantly higher in group B than that in groups A and C (P<0.05), but there was no statistical difference between groups A and C (P>0.05). Immunohistochemical examination revealed NF-κB-positive products were localized predominantly in the hepatocytes, and also in the inflammatory cells and Kupffer cells. These products could be divided into three types:cytosolic type, karyotype, and nuclear-cytoplasm type, and they existed alone or in combination.ConclusionExposure to +10Gz, especially in the early stage, acts as a stress to induce the activation of NF-κB, suggesting that NF-κB plays an important role in the cascade reactions and adaptation to the acceleration stress.

acceleration; liver injury ; NF-kappa B; immunohistochemistry; blotting, Western

R852.21

A

0577-7402(2015)07-0595-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.17

2014-12-09；

2015-01-17)

(責任編輯：李恩江)

全軍醫(yī)學科技“十二五”項目面上項目(CKJ12J022)

劉壘，碩士研究生。主要從事航空環(huán)境下加速度對肝膽系統(tǒng)影響的研究

100142 北京 空軍總醫(yī)院肝膽外科(劉壘、張洪義、胡深、常鵬、史斌、李文兵)

張洪義，E-mail：zhhyiyi1487@163.com