李衛(wèi)平，張江南

·臨床研究·

細(xì)胞型朊蛋白(PrPC)在直腸癌和直腸腺瘤中的表達(dá)及其臨床意義

李衛(wèi)平，張江南

目的檢測(cè)細(xì)胞型朊蛋白(PrPC)在正常直腸黏膜、直腸腺瘤及直腸癌組織中的表達(dá)情況，并探討其與直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法檢測(cè)PrPC在直腸癌(60例)、直腸腺瘤(20例)及正常直腸組織(20例)中的表達(dá)水平，并分析其在直腸癌組織中的表達(dá)與患者性別、腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果PrPC在正常直腸、直腸腺瘤及直腸癌中均有表達(dá)，在直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為65%(39/60)，明顯高于直腸腺瘤(35%)及正常直腸組織(15%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相關(guān)分析顯示，PrPC在直腸癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤位置及腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)rPC可能在直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

朊病毒；直腸腫瘤；病理學(xué)，臨床

直腸癌是人類消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，由于早期臨床癥狀不明顯，患者就診時(shí)大多屬中晚期，目前手術(shù)切除仍是主要的治療方法，但術(shù)后總的5年生存率僅60%左右[1]，因此尋找直腸癌腫瘤標(biāo)志物對(duì)其早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療具有十分重要的意義[2]。細(xì)胞型朊蛋白(cellular prion protein，PrPC)廣泛存在于多種正常組織器官，在哺乳動(dòng)物中非常保守，但其生理功能并不十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)PrPC在胃癌、胰腺癌、腸癌和乳腺癌等癌細(xì)胞中均有較高表達(dá)且能增進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)增和抗藥性，提示其與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系[3-6]。PrPC在直腸癌中的表達(dá)及意義目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)PrPC在正常直腸黏膜、直腸腺瘤及直腸癌組織中的表達(dá)情況，初步探討其在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用，為直腸癌的預(yù)防、診斷及治療提供新的研究思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科2013年6月－2014年4月手術(shù)切除的直腸癌標(biāo)本60例，其中男32例，女28例，年齡51.2±3.6歲(36例年齡≥60歲，24例年齡<60歲)，中/高位(距齒狀線5cm以上)35例，低位(距齒狀線5cm以下)25例，術(shù)后標(biāo)本檢查腫瘤大小(以最大直徑計(jì)算)≥3cm者30例，<3cm者30例，中/高分化及低分化者分別為42例和18例，根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)結(jié)直腸癌TNM分期(第7版)[7]，Ⅰ－Ⅱ期及Ⅲ－Ⅳ期者分別為22例及38例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者分別為36例及24例。同期收集直腸腺瘤和正常直腸(距癌腫2cm之外，經(jīng)HE染色證實(shí)為無(wú)病變組織)標(biāo)本各20例作為對(duì)照。所有入選患者資料齊全，術(shù)前無(wú)放化療史，術(shù)后經(jīng)病理確診。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人PrPC多克隆抗體(ab6664)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，生物素化山羊抗兔HRP-conjugated IgG二抗、DAB顯色試劑盒、正常山羊血清、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶(streptavidin-peroxidase，SP)、蘇木素及0.5%伊紅染色液等均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；光學(xué)顯微鏡(CKX41-F32F)為日本Olympus公司產(chǎn)品，石蠟切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品，–80℃超低溫冰箱為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品，圖像采集系統(tǒng)為法國(guó)JENA公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組化檢測(cè) 所有標(biāo)本取石蠟包埋，行4μm連續(xù)切片，60℃恒溫箱中烘干后保存，石蠟切片依次經(jīng)脫蠟、水化后，3%H2O2浸泡10min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS浸泡5min，再加入檸檬酸緩沖液于高壓鍋中煮沸10min修復(fù)抗原，滴加正常山羊血清封閉抗原，然后加入PBS液稀釋兔抗人PrPC多克隆抗體(1:200)，4℃過(guò)夜，PBS清洗3次，加入山羊抗兔HRP-conjugated IgG二抗室溫孵育1h，PBS清洗3次，滴加SP，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明及中性樹(shù)膠封片后鏡檢。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 顯微鏡下觀察到胞核和(或)胞質(zhì)呈棕色或黃色判定為陽(yáng)性著色，隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色深淺對(duì)組織染色進(jìn)行賦值。陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%計(jì)0分，10%～25%計(jì)1分，25%～50% 計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分。無(wú)染色為陰性(0分)，細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)呈淡棕色為弱陽(yáng)性(1分)，呈棕色者為陽(yáng)性(2分)，深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性(3分)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度得分的乘積對(duì)組織染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分分級(jí)：0～2分為陰性(-)，3～5分為弱陽(yáng)性(+)，6～8分為陽(yáng)性，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性陽(yáng)性率=(陽(yáng)性例數(shù)+強(qiáng)陽(yáng)性例數(shù))/總例數(shù)×100%。所有免疫組化結(jié)果由本院兩位病理醫(yī)師在不知臨床和病理資料的情況下進(jìn)行評(píng)估。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正常直腸、直腸腺瘤及直腸癌中PrPC表達(dá)率差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，直腸癌中PrPC表達(dá)與臨床參數(shù)相關(guān)性的分析采用Spearman檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PrPC在不同直腸組織中的表達(dá)情況 在直腸癌、直腸腺瘤及正常直腸組織均可見(jiàn)PrPC陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核(圖1)。PrPC在正常直腸及直腸腺瘤組織的中陽(yáng)性表達(dá)率分別為15%(3/20)及35%(7/20)，而在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為65%(39/60)，明顯高于正常結(jié)腸組織及直腸腺瘤組織(P<0.01，表1)，其陽(yáng)性率隨分化程度下降而升高，即正常黏膜-腺瘤-癌序列中PrPC表達(dá)逐漸升高。

2.2 PrPC在直腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 Spearman檢驗(yàn)顯示，直腸癌組織中PrPC陽(yáng)性率與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤位置及腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05，表2)。

圖1 PrPC在直腸癌中的表達(dá)(SP法)Fig. 1 Expression of PrPCin rectal cancer tissue (SP) A. Rectal cancer tissue (×200)；B. Rectal cancer tissue (×400)；C. Negative control (×200)

表1 PrPC在不同直腸組織中的陽(yáng)性表達(dá)率比較Tab. 1 Comparison of the positive rate of PrPCin different rectal tissues

表2 直腸癌組織中PrPC表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 2 Relationship of the PrPCexpression in rectal cancer tissue to the clinical pathological parameters

3 討 論

朊蛋白(prion protein，PrP)由美國(guó)科學(xué)家Prusiner首先發(fā)現(xiàn)并命名，包括PrPC和致病型朊蛋白(PrPSc)，兩者的分子量均為33～35kD，且是異構(gòu)體，由同一染色體的PrP基因(PRNP)編碼，具有完全相同的氨基酸序列，差別在于空間構(gòu)型不同，導(dǎo)致二者的蛋白功能有極大差異[8]。正常的細(xì)胞型構(gòu)象PrPC沒(méi)有致病性，但在一定條件下可以轉(zhuǎn)化成致病型PrPSc這種異常構(gòu)象，從而導(dǎo)致朊病毒疾病的發(fā)生[9]。人類PrPC由PRNP基因編碼，PRNP位于20號(hào)染色體短臂上，編碼253個(gè)氨基酸，由于PRNP基因剔除小鼠沒(méi)有明顯的表現(xiàn)型，導(dǎo)致該蛋白的功能在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)不明確。PrPC是一個(gè)在人體內(nèi)分布較廣的糖蛋白，從單細(xì)胞的酵母到魚(yú)類、鳥(niǎo)類、兩棲類、爬行類及哺乳動(dòng)物等真核生物中均存在PrPC，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，PrPC主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，以神經(jīng)元的表達(dá)量最高，如腦、脊髓和外周神經(jīng)組織，其次為胃、腸道、乳腺、脾臟等器官[10]。研究顯示PrPC在胃癌、胰腺癌、腸癌、乳腺癌及口腔鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤組織及細(xì)胞株中的含量顯著升高，提示其可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11-13]。近年來(lái)隨著對(duì)PrP的深入研究，發(fā)現(xiàn)PrPC對(duì)胃癌、胰腺導(dǎo)管腺癌及腸癌等消化系統(tǒng)癌癥的惡性化(如抗藥性及癌細(xì)胞的遷移等)均有促進(jìn)作用[14]。

研究顯示PrPC在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞株中呈高表達(dá)[5,15-17]。在大腸癌組織中高表達(dá)的PrPC能夠通過(guò)Fyn-HIF-2α-Glut1途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的抗PrP特異性抗體(BAR221和F89/160.1.5)能在體外實(shí)驗(yàn)中有效抑制癌細(xì)胞的增殖，并在不同程度上加強(qiáng)化療藥物(伊立替康、5-FU、順鉑和阿霉素)的療效[19]。但目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)PrPC在直腸癌及直腸腺瘤中的表達(dá)及其臨床意義尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究利用免疫組化SP法檢測(cè)PrPC在正常直腸黏膜、直腸腺瘤及直腸癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示直腸癌組織中的PrPC表達(dá)于細(xì)胞核，且其陽(yáng)性率明顯高于正常直腸黏膜及直腸腺瘤，同時(shí)其表達(dá)水平與直腸癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而與患者的性別、年齡、腫瘤位置及腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性，表明PrPC可能在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，提示PrPC有望作為直腸癌早期診斷、生物靶向治療及預(yù)后判斷的腫瘤生物標(biāo)記物。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示PrPC在直腸癌中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與直腸癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步應(yīng)用siRNA、基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)進(jìn)行深入研究。

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Expression and clinical significance of cellular prion protein in rectal cancer and adenoma

LI Wei-ping, ZHANG Jiang-nan*
Department of Gastrointestinal Surgery, First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: zjnss@sina.com

, E-mail: zjnss@sina.com
This work was supported by the Science and Technology Planning Project of Jiangxi Health and Family Planning Commission (20155197)

ObjectiveTo determine the expressions of cellular prion protein (PrPC) in normal rectal mucosa, rectal adenoma and rectal carcinoma tissues, and to study the relationship of PrPCwith development and progression of rectal carcinoma.MethodsImmunohistochemical method (SP method) was used to determine the expressions of PrPCin rectal carcinoma (60 samples), rectal adenoma (20 samples) and normal rectal mucosa (20 samples), and the correlations between the expression of PrPCin rectal carcinoma tissue, and clinical pathological parameters including sex, tumor differentiation, clinical stages, lymph node metastasis, etc. were analyzed.ResultsPrPCwas expressed in normal rectal mucosa, rectal adenoma and rectal carcinoma tissues. The positive rate of PrPCexpression in rectal carcinoma (65%) was significantly higher than that in rectal adenoma (35%) and normal rectal mucosa (15%) with statistical significance (P<0.01). The correlation analysis showed that the positive rate of PrPCwas closely related with tumor differentiation, TNM stage and lymph node metastasis (P<0.05), while there was no significant correlation with sex, age, tumor location and tumor size (P>0.05).ConclusionPrPCmay play an important role in the process of development, progression and metastasis of rectal carcinoma.

prions; rectal neoplasms; pathology, clinical

R735.37

A

0577-7402(2015)07-0574-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.12

2014-12-01；

2015-05-24)

(責(zé)任編輯：胡全兵)

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃課題(20155197)

李衛(wèi)平，碩士研究生。主要從事消化道腫瘤方面的基礎(chǔ)與臨床研究

330006 南昌 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科(李衛(wèi)平、張江南)

張江南，E-mail：zjnss@sina.com