張紅梅，劉學杰，王婧雅，張小茜

HIF-2α、ABCG2、OCT-4與胃癌化療耐藥的關系研究

張紅梅，劉學杰，王婧雅，張小茜

目的探討HIF-2α、ABCG2、OCT-4與人胃癌化療耐藥的關系。方法2011年1月－2013年6月在我院消化科就診的符合條件的經電子胃鏡和病理證實為晚期胃癌的患者52例，均采用FOL-FOX4全身化療，根據化療效果的不同分為有效[包括完全緩解(CR)和部分緩解(PR)]組、穩(wěn)定(SD)組、進展(PD)組。采用RT-PCR、免疫組織化學染色檢測不同治療效果腫瘤組織中HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表達。結果52例患者經過4周期FOL-FOX4方案化療，其中CR 2例，PR 19例，SD 25例，PD 6例。即有效(CR+PR)組21例(40.4%)，穩(wěn)定組25例(48.1%)，進展組6 例(11.5%)。CR+PR組中HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白呈低水平表達，SD組HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表達較CR+PR組明顯增加，PD組表達進一步增加，CR+PR組、SD組和PD兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論HIF-2α、ABCG2、OCT-4等腫瘤干細胞標記物的mRNA和蛋白在腫瘤組織中的表達水平與腫瘤的化療效果有關，其高水平表達或許是化療效果差和耐藥的主要原因之一。

胃腫瘤；抗腫瘤聯(lián)合化療方案；抗藥性，腫瘤

對于腫瘤晚期失去手術機會或因心肺功能障礙不宜手術的患者，進行以化療為主的綜合治療是提高患者生存率、延長壽命的關鍵因素。5-氟尿嘧啶(5-Fu)和奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)都是抗代謝的化療藥物，是國內外腫瘤臨床輔助化療和新輔助化療最常用的藥物。但由于患者個體差異以及腫瘤本身異質性的存在，不同患者對治療的反應和治療效果存在差異[1]。化療耐藥的產生不僅導致治療效果差，而且會對腫瘤患者的免疫功能產生很大損害[2]。本研究通過檢測腫瘤組織中HIF-2α、ABCG2、OCT-4的表達，以期找到與化療療效和化療耐藥相關的標記物，幫助臨床醫(yī)師有針對性地選擇化療方案，避免不必要的細胞毒性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年1月－2013年6月在我院消化科就診的經電子胃鏡和病理證實為晚期胃癌的患者52例，包括不具備手術條件的晚期胃癌患者和雖具備手術條件，但因年齡大、心肺功能差或其他原因拒絕手術的胃癌患者。其中男29例，女23例，平均年齡59(30～81)歲。

1.2 主要試劑 5-Fu為江蘇振國藥業(yè)有限公司生產，L-OHP購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。HIF-2α、OCT-4、ABCG2多克隆抗體及免疫組化試劑盒均為Abcam公司產品，Trizol試劑為Invitrogen公司產品，反轉錄試劑盒及PCR試劑盒均購自Fermentas公司。

1.3 治療方法 52例患者均用采用FOL-FOX4全身化療：L-OHP 85mg/m2，靜脈滴注2h，第1天；亞葉酸鈣(LV)200mg/m2，靜脈滴注2h，第1～2天；5-Fu 400mg/m2，快速靜脈滴注0.5h，5-Fu 600mg/ m2，持續(xù)靜脈滴注22h，第1～2天。每2周重復，28d為1個周期，并使用格拉司瓊、胃復安等止吐治療，共用4個周期。每周期無延時。療程結束4周后行電子胃鏡及上腹部CT檢查，評價治療效果。

1.4 治療效果評價 腫瘤客觀療效評定參照WHO實體瘤療效評價統(tǒng)一標準[3]。①完全緩解(CR)：病灶完全消失并持續(xù)4周以上；②部分緩解(PR)：病灶縮小50%以上并持續(xù)4周以上；③穩(wěn)定(SD)：病灶縮小不及50%或增大不超過20%，無新病灶出現(xiàn)；④進展(PD)：腫瘤增大超過20%。按照治療效果分為3組：有效組(包括CR和PR)、穩(wěn)定組、進展組。

1.5 免疫組織化學法檢測腫瘤組織中HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白表達水平的變化 將采集的各組標本用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。每組腫瘤組織免疫組織化學染色按SP-9000試劑盒步驟進行，DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：HIF-2α、OCT-4和ABCG2陽性結果為細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用圖像分析軟件檢測HIF-2α、ABCG2、OCT-4陽性細胞的平均吸光度(A)值，以反映蛋白的相對表達量，并取其平均值。

1.6 RT-PCR法檢測HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA在不同組織表達水平的變化 采用Trizol法提取腫瘤組織總RNA，以1ml DEPC水溶解。反轉錄合成cDNA第一鏈，反應條件：70℃ 5min，速置于冰上；37℃ 5min；37℃ 60min；70℃ 10min，置冰上進行后續(xù)試驗或–20℃保存。HIF-2α上游引物序列：5'-CTTGGAGGGTTTCATTGCTGTGGT-3'，下游引物序列：5'-GTGAAGTCAAAGATGCTGTGTCC T-3'，產物長度為123bp；ABCG2上游引物序列：5'-CCCTTATGATGGTGGCTTATTC-3'，下游引物序列：5'-GTGAGATTGACCAACAGACCAT-3'，產物長度為1 3 2 b p；O CT-4上游引物序列：5'-CCCGAAAGAGAAAGCGAACC-3'，下游引物序列：5'-CAGAACCACACTCGGACCAC-3'，產物長度為151bp。GAPDH上游引物序列：5'-GCACCACCAACTGCTTAGCAC-3'，下游引物序列：5'-GCAGCGCCAGTAGAGGCAGG-3'， 產物長度為143 bp。PCR反應條件為：94℃ 5min；94℃30s， 50℃ 30s， 72℃ 60s，40個循環(huán)；72℃延伸10min。以HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNAA值與GAPDHA值的比值表示mRNA的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 治療效果 52例患者進行4個周期的FOLFOX4方案化療，結束后4周行電子胃鏡及上腹部CT檢查，治療效果如下：CR 2例，PR 19例，SD 25例，PD 6例。即有效組(CR+PR)21例(40.4%)，穩(wěn)定組(SD)25例(48.1%)，進展組(PD)6例(11.5%)。

2.2 腫瘤組織中HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白的表達 HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白陽性表達呈棕黃色顆粒狀，主要彌散分布于整個胞質或沿核膜周邊呈線狀分布，強陽性時細胞核亦可見表達。PD組人胃癌組織中HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白的表達最強，其次為SD組，CR+PR組3種蛋白的表達明顯減弱，基本不表達。CR+PR組與SD組、PD組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

2.3 腫瘤組織中HIF-2α、ABCG2、Oct-4 mRNA的表達 CR+PR組HIF-2α、ABCG2、Oct-4 mRNA呈低水平表達，SD組HIF-2α、ABCG2、Oct-4 mRNA的表達較CR+PR明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，PD組的表達較SD組進一步增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CR+PR組、SD組和PD組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1 免疫組化法檢測腫瘤組織HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白的表達(×400)Fig.1 Expressions of HIF-2α, ABCG2 and OCT-4 proteins (Immunocytochemistry, ×400)

圖2 RT-PCR檢測腫瘤組織中HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA的表達Fig.2 Expressions of HIF-2α, ABSG2 and Oct-4 mRNA in human gastric cancer (RT-PCR)A. CR+PR group; B. SD group; C. PD group. (1)P<0.05 compared with CR+PR group; (2)P<0.05 compared with SD group

3 討 論

進展期胃癌以綜合治療為主，化療是其主要方法之一，但癌細胞多藥耐藥的產生使得化療藥物的應用受到明顯限制。與順鉑和卡鉑比較，L-OHP毒性顯著降低，更容易與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應用，以L-OHP和5-Fu聯(lián)合的FOL-FOX4方案已成為治療進展期胃癌的首選化療方案[4]。但由于腫瘤細胞多藥耐藥的存在，L-OHP在臨床使用過程中也存在明顯的耐藥現(xiàn)象[5]。5-Fu是FOL-FOX4方案中另一起主要作用的藥物，它通過影響細胞DNA的合成導致細胞損傷和死亡，誘導凋亡是其抗腫瘤機制之一[6]，此外5-Fu還是細胞周期特異性藥物，對細胞各個周期均有抑制作用，以S期的作用最佳[7]，但患者癌細胞耐藥性的存在降低了的5-Fu實際療效。根據前期經驗、相關專家意見以及小規(guī)模的臨床試驗結果，同時考慮到化療療效和毒副作用，我們對本組患者采用FOL-FOX4方案進行化療，結果顯示，采用5-Fu與L-OHP聯(lián)合的FOLFOX4方案治療晚期胃癌患者，有效率為40.4%，與國內外研究基本一致[8-10]，即仍有相當一部分患者對FOL-FOX4方案耐藥。對不適合手術的晚期胃癌患者如何有選擇性地應用化療方案，避免不必要的細胞毒化療，成為亟待解決的重要問題。

近年研究認為，腫瘤組織中存在數量很少但自我更新能力和多向增殖潛能較強的細胞即腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)，與腫瘤的產生、轉移、復發(fā)及耐藥有關[11-12]。但至目前，由于許多腫瘤干細胞標志物還未確定，尚無法直接分離鑒定其中的干細胞。低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)與腫瘤的血管生成、侵襲轉移及放化療抵抗等惡性生物學行為有關[13]。HIFs包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，其中HIF-2α與CSCs的關系更密切，可通過調控多種干細胞有關通路來維持干細胞表型。ATP結合盒基因2(ATP-Binding cassette gene 2，ABCG2)是一種ABC轉運蛋白，可外排多種化療藥物，在腫瘤組織中高表達，導致腫瘤對多種化療藥物不敏感[14]。研究發(fā)現(xiàn)，多種CSCs高表達ABCG2，后者還是HIF-2α的直接靶基因，HIF-2α-ABCG2通路高表達可導致CSCs的多藥耐藥[15]。OCT-4屬于POU轉錄因子成員，是一種多能干細胞標記物，有研究認為OCT-4也與CSCs關系密切[16-17]。最近Wang等[18]報道肝細胞癌中存在一條潛在的腫瘤細胞化療抵抗軸OCT4-AKT-ABCG2，可見CSCs 中OCT-4的高表達亦可與ABCG2協(xié)同促進腫瘤的化療抵抗。另外，ABCG2也是HIF-2α的直接靶基因，HIF-2α-ABCG2通路高表達可導致CSCs多藥耐藥[19]。

目前研究顯示，L-OHP的耐藥機制可能與外排藥物增加有關[20]：細胞膜上的膜轉運蛋白可將藥物“泵”出細胞外，導致細胞內藥物濃度降低，從而導致耐藥。ABCG2的表達升高可促進化療藥物在體內排泄，因而增加腫瘤細胞對化療藥物的耐受性。而腫瘤微環(huán)境及基因突變是5-Fu耐藥的機制之一，我們前期的研究證實腫瘤低氧微環(huán)境導致HIF-2α表達升高，可誘導干細胞標記物ABCG2和OCT-4的表達[21]；OCT-4對維持干細胞的未分化狀態(tài)至關重要，可使細胞處于G0期，對作用于S期的化療藥物氟尿嘧啶產生抵抗[22]。

我們前期的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)[23]，裸鼠胃癌移植瘤腹腔注射5-Fu后，HIF-2α、ABCG2、OCT-4 的mRNA和蛋白表達增加，表明體內外胃癌細胞對5-Fu的化療抵抗可能與誘導腫瘤干細胞標記物HIF-2α、ABCG2、OCT-4高表達，促進腫瘤細胞的干細胞化有關。本研究結果顯示，CR+PR組腫瘤組織HIF-2α、ABCG2、Oct-4 mRNA和蛋白呈低水平表達，SD組表達較CR+PR組增加，PD組表達則進一步增加，進一步提示HIF-2α、ABCG2、OCT-4等基因和蛋白的高表達是導致腫瘤化療效果差的重要原因，也是化療耐藥的重要標記物。HIF-2α、ABCG2、OCT-4有望成為晚期胃癌患者以FOL-FOX4為基礎的化療療效的新型預測因子。一方面，在晚期胃癌患者化療開始之前，可先檢測患者HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA和蛋白的表達水平，根據表達情況有針對性地選擇治療方案，HIF-2α、ABCG2、OCT-4高表達患者不建議給予FOL-FOX4化療。另一方面，近年來隨著基因治療熱潮的不斷涌起，對于HIF-2α、ABCG2、OCT-4基因表達水平較高的患者，亦可以采用反義核苷酸或siRNA基因敲除等技術干擾HIF-2α、ABCG2、OCT-4的表達而逆轉耐藥，從而實現(xiàn)真正意義上的個體化治療。

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Correlation of HIF-2α, ABCG2 and OCT-4 with chemotherapy resistance in human gastric cancer

ZHANG Hong-mei1, LIU Xue-jie1, WANG Jing-ya2, ZHANG Xiao-qian1*1Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang 261031, China
2Department of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: 13853697396@163.com

, E-mail: 13853697396@163.com
This study was supported by the Science and Technology Program of Shandong Province (2012YD18108) and the Science and Technology Innovation Foundation of the Affiliated Hospital of Weifang Medical University (2012)

ObjectiveTo investigate the correlation of HIF-2α, ABCG2 and OCT-4 with chemotherapy resistant gastric cancer in humans.MethodsFifty-two patients who were confirmed to have advanced gastric cancer with the aid of electronic endoscopy and pathology in the Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Weifang Medical College, were enrolled in the study. According to the effect of FOL-FOX4 chemotherapy that these patients had experienced, they were divided into three groups: CR+PR (complete remission+partial remission) group, SD (stable disease) group and PD (progressive disease) group. The expression levels of HIF-2α, ABCG2, and OCT-4 mRNA and protein were assessed in different groups by using RT-PCR and immunocytochemistry.ResultsTwo patients achieved CR, 19 achieved PR, 25 showed SD, and 6 showed PD. In other words, CR+PR were seen in 21 patients (40.4%), SD in 25(48.1%), PD in 6(11.5%). In CR+PR group, the expression levels of HIF-2α, ABCG2 and OCT4 mRNA and protein were low, but the above mentioned expressions were significantly increased in SD group and PD group. The expression levels of HIF-2α, ABCG2 and Oct-4 mRNA and protein were highest in the PD group, lower in the SD group, and lowest in the CR + PR groups (allP<0.05).ConclusionsThe expression of the markers HIF-2α, ABCG2 and OCT4 in human tumor tissues is related to the effect of chemotherapy for gastric cancer. A high expression of tumor markers is perhaps the main reason for low efficacy of chemotherapy due to drug resistance.

stomach neoplasms; antineoplastic combined chemotherapy protocols; drug resistance, neoplasm

R735.2

A

0577-7402(2015)10-0816-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.10.09

2015-04-19；

2015-07-16)

(責任編輯：熊曉然)

山東省科技發(fā)展計劃(2012YD18108)；濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院前沿探索重點研究基金(2012)

張紅梅，副主任醫(yī)師。主要從事消化道腫瘤的基礎與臨床研究

261031 山東濰坊 濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科(張紅梅、劉學杰、張小茜)；261053 山東濰坊 濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學系(王婧雅)

張小茜，E-mail :13853697396@163.com