何薇薇 安 峰 林媛媛 王曉明 商煒娜

有學(xué)者研究證實(shí)，即便在沒(méi)有其他微生物存活的情況下，糞腸球菌也能夠耐受根管內(nèi)營(yíng)養(yǎng)缺乏的惡劣環(huán)境，并且能夠侵入牙本質(zhì)小管，在導(dǎo)致根管系統(tǒng)感染的細(xì)菌當(dāng)中，糞腸球菌是最難以清除的微生物之一[1]。本實(shí)驗(yàn)研究旨在離體牙上建立糞腸球菌感染根管的模型，來(lái)檢測(cè)不同沖洗劑對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的抗菌效果。

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 挑選河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔門診新鮮拔除的40 顆單根管牙，去除根周軟組織、牙石等，清洗干凈后放在生理鹽水中4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜{入標(biāo)準(zhǔn):要求單根管，根尖孔閉合，無(wú)近髓齲壞或充填體，根裂等缺陷。

1.2 離體牙預(yù)備 用無(wú)菌金鋼砂片切除牙冠，保留牙根長(zhǎng)度為15mm。常規(guī)消毒拔髓，首先用機(jī)用Protaper 器械中的SX 敞開(kāi)根管口，然后用S1、S2、F1、F2 逐序進(jìn)行預(yù)備，根管預(yù)備過(guò)程中每換一次器械用0.9%NaCl 溶液沖洗，時(shí)間為1min。預(yù)備完畢后，用樹(shù)脂在根尖部做封閉。然后將所有離體牙放入含有5ml 腦心浸潤(rùn)液(BHI 肉湯)的試管中，121℃高溫高壓下滅菌20min，靜置于5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)，如BHI 肉湯在24h 后無(wú)混濁，即認(rèn)定滅菌完全。

1.3 感染模型的建立 在超凈工作臺(tái)上，常溫下將糞腸球菌冰凍液復(fù)蘇，將其接種于BHI 肉湯中， 用比濁儀調(diào)整渾度為0.5M 的標(biāo)準(zhǔn)菌液備用.將所有牙根分別浸泡在包含糞腸球菌混濁度為1.5×108CFU/ L 的BHI 中，孵育箱孵育，隔日更換一次新鮮培養(yǎng)菌液至21d，并隨機(jī)抽取任一標(biāo)本菌液進(jìn)行微生物檢測(cè)，根據(jù)菌落形態(tài)及革蘭染色，確定無(wú)雜菌污染。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將已感染糞腸球菌的離體牙模型，隨機(jī)分為五組，每組各8 例樣本，分別用0.2%濃替硝唑含漱液(A 組)，MTAD 沖洗液(B組)，3%雙氧水(C 組)，2.5%NaClO(D 組)，0.9%NaCl(E 組)沖洗。

1.5 感染模型的取樣及細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù) 所有樣本用蠟包埋在無(wú)蓋塑料容器中，均按下頜牙位操作。

1.5.1 第一次取樣(N1) 根管沖洗前戴無(wú)菌手套用無(wú)菌鑷子夾持30 號(hào)無(wú)菌吸潮紙尖按照記錄的工作長(zhǎng)度插入根管內(nèi)停留1min，吸取根管內(nèi)液后，立即放入裝有100μm 生理鹽水的Eppendorf管中混勻，10 倍系列稀釋，分別接種于BHI 血瓊脂平皿上，37℃下CO2孵育箱中培養(yǎng)，48h 后計(jì)數(shù)菌落數(shù)(CFU／ml)，記為N1(圖1、圖3、圖5、圖7、圖9)。

1.5.2 第二次取樣(N2) 在無(wú)菌條件下用手動(dòng)不銹鋼K 銼繼續(xù)預(yù)備離體牙的根管中下段，預(yù)備至40 號(hào)，每更換一次器械時(shí)分別按照上述的五組沖洗液進(jìn)行根管沖洗。最后為避免沖洗液的過(guò)度作用，用2ml 蒸餾水沖洗根管。然后用無(wú)菌鑷子夾持30 號(hào)無(wú)菌吸潮紙尖按照記錄的工作長(zhǎng)度插入根管內(nèi)停留1min，吸取根管內(nèi)液，放入裝有100μm 生理鹽水的Eppendorf 管中，10 倍系列稀釋，送培養(yǎng)計(jì)數(shù)，記為N2(圖2、圖4、圖6、圖8、圖10)。

沖洗方法：沖洗時(shí)，使用23G 直徑0.6mm 側(cè)向開(kāi)口針頭插入工作長(zhǎng)度后退1mm 并上下提拉、左右移動(dòng)針頭。每次沖洗使用5ml 沖洗液用時(shí)1min。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

對(duì)沖洗前后的CFU 數(shù)據(jù)做lgCFU 轉(zhuǎn)換，利用方差分析做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

附表 幾種沖洗液沖洗前后根管內(nèi)細(xì)菌量的變化(±s)

附表 幾種沖洗液沖洗前后根管內(nèi)細(xì)菌量的變化(±s)

沖洗液組 樣本數(shù) 沖洗前N1 沖洗后N2 差值A(chǔ) 組 8 例 8.6915±0.1527 3.1894±0.2338 5.5020±0.3001 B 組 8 例 8.7135±0.1506 1.9943±0.4835 6.7192±0.4458 C 組 8 例 8.6701±0.1724 6.1193±0.2733 2.5508±0.3526 D 組 8 例 8.6758±0.1133 3.1815±0.0723 5.4944±0.1058 E 組 8 例 8.6758±0.1133 7.6701±0.1724 1.0057±0.2420

2. 結(jié)果

根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果附表顯示：沖洗前五組根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)過(guò)沖洗后除0.9%NaCl(E 組)和3%雙氧水(C 組)外，其他三組均有效地降低了根管內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量，較沖洗前細(xì)菌CFU 下降量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。沖洗前后細(xì)菌差值的兩兩比較:B 組與A 組、D 組間差異有顯著性(P＜0.05)，A 組和D組間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。圖1-圖10 為各組在使用沖洗劑沖洗前、后根管內(nèi)糞腸球菌的培養(yǎng)圖片。

圖1 沖洗前(A 組)

圖2 沖洗后(A 組)

圖3 沖洗前(B 組)

圖4 沖洗后(B 組)

圖5 沖洗前(C 組)

圖6 沖洗后(C 組)

圖7 沖洗前(D 組)

圖8 沖洗后(D 組)

圖9 沖洗前(E 組)

圖10 沖洗后(E 組)

3. 討論

細(xì)菌一直被公認(rèn)是根管及根尖周病損發(fā)展的主要致病因素[2，3]。成功的根管治療取決于徹底地化學(xué)機(jī)械清理牙髓組織，牙本質(zhì)碎片和感染的微生物。根管沖洗劑可以通過(guò)沖掉碎屑增加機(jī)械清理的效果，溶解組織并消毒根管系統(tǒng)?；瘜W(xué)清理尤其適用于復(fù)雜的牙齒內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)(如根管峽部)和易被機(jī)械清理遺漏的其他不規(guī)則區(qū)域[4]。

近年來(lái)，糞腸球菌的作用越來(lái)越受到口腔學(xué)者的關(guān)注。George 等[5]觀察到當(dāng)糞腸球菌在營(yíng)養(yǎng)充足且有氧的條件下生長(zhǎng)時(shí)， 可形成結(jié)構(gòu)龐大、不規(guī)則的生物膜結(jié)構(gòu)， 而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)在生物膜中存在的鈣的水平會(huì)增加，這時(shí)細(xì)菌主要依靠周圍這種鈣化的基質(zhì)保護(hù)而在生物膜中長(zhǎng)期存活。因糞腸球菌的直徑僅為0.5-1μm，而牙本質(zhì)小管的直徑平均為1-4μm ，所以糞腸球菌相對(duì)大多數(shù)細(xì)菌更易進(jìn)入牙本質(zhì)小管[6]。所以本實(shí)驗(yàn)建立糞腸球菌體外根管感染模型，并用傳統(tǒng)根管沖洗劑與MTAD 做對(duì)照。

根管沖洗劑是具有殺菌、溶解壞死組織作用的無(wú)刺激性水溶液，在根管機(jī)械預(yù)備時(shí)使用可增進(jìn)根管內(nèi)細(xì)菌及碎屑的清除。幾十年來(lái)，多種不同濃度的次氯酸鈉被用作根管沖洗劑。次氯酸鈉的主要優(yōu)勢(shì)是它對(duì)壞死組織的溶解能力及對(duì)大多數(shù)微生物的抗菌性能[7]較強(qiáng)大。它的弊端是難聞的氣味、高毒性、不能去除玷污層[8]。次氯酸鈉的組織溶解能力及抗菌性能與其濃度有關(guān)，并受pH 值及溫度等影響在臨床上使用高濃度次氯酸鈉進(jìn)行根管內(nèi)沖洗時(shí)需配合橡皮障[9]。0.2%濃替硝唑含漱液為抗厭氧菌藥，它可抑制細(xì)菌DNA 的合成，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。3%H2O2是臨床上常用的根管沖洗劑，當(dāng)其遇到有機(jī)物如：組織液、血液、膿液、細(xì)菌時(shí)，可釋放出新生態(tài)氧，使細(xì)菌體內(nèi)活性基團(tuán)氧化，干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)，對(duì)厭氧菌的作用尤其明顯。因雙氧水與有機(jī)物接觸會(huì)很快釋放出氧而發(fā)生發(fā)泡現(xiàn)象，這種發(fā)泡作用有助于在器械擴(kuò)挫根管時(shí)將血液、殘髓帶出，漂浮至表面便于清除。但其為酸性溶液，它對(duì)根尖周組織及黏膜有一定刺激作用，在臨床根管沖洗時(shí)如操作不當(dāng)可引起皮下氣腫。MTAD 是一種以多西霉素、檸檬酸和清潔劑聚山梨醇酯80 為主要成分的沖洗劑，是一種新的有抗菌作用的根管沖洗劑，溶液呈酸性，pH 值為2.15，生物相容性好。Torabinejad 等[10]的體外研究，MTAD 稀釋200 倍可有效殺死糞腸球菌；次氯酸鈉稀釋32 倍以上就不具備抗菌作用；而EDTA 不具備任何抗菌作用。只有MTAD 在2-5min 內(nèi)可以殺死暴露在其內(nèi)的糞腸球菌。本實(shí)驗(yàn)研究的MTAD 對(duì)感染根管消毒效果的研究結(jié)果與之前其他學(xué)者的報(bào)道相似[11]。MTAD 在消毒根管內(nèi)及牙根表面的能力主要取決于多西環(huán)素的抗菌效果，在檸檬酸的作用下多西環(huán)素可去除牙根表面的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物，其效力取決于它的低PH、抗膠原酶活性及其結(jié)合牙本質(zhì)的能力。MTAD 里的清潔劑可幫助沖洗液進(jìn)入根管和牙本質(zhì)小管。MTAD 通過(guò)清潔劑的作用可減少牙齒的表面張力，提高其在根管內(nèi)的抗菌性能[12-13]。有學(xué)者通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)MTAD 還有去除玷污層的能力[14-15]。所以綜合以上，MTAD 具有多種優(yōu)良性能。

本實(shí)驗(yàn)在離體牙根管預(yù)備時(shí)分別用0.2%濃度替硝唑含漱液，MTAD 沖洗液，3%雙氧水，2.5%NaClO 和0.9%NaCl 沖洗，沖洗過(guò)程中每組使用的沖洗方法、器械、時(shí)間、藥量均相同，排除了這些因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能造成的影響。結(jié)果顯示，MTAD 雖不能完全清除根管內(nèi)的糞腸球菌，但與其他根管沖洗劑比較沖洗前后CFU 的減少量較多，MTAD 沖洗液對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的抗菌性能明顯優(yōu)于其他組。但由于本次實(shí)驗(yàn)選用的為根管系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單的單根管離體牙，且不能完全模擬患者口腔內(nèi)的細(xì)菌環(huán)境，所以MTAD 在人體內(nèi)對(duì)抗糞腸球菌是否具備優(yōu)越抗菌效果還有待于進(jìn)一步研究。

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