南延榮,解雁飛,薛瑞娟,張紅莉,南 剛,李 麗,李紅梅

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科一病區(qū)，陜西 延安716000)

Caspase3在羊水過少孕產(chǎn)婦血清中的表達(dá)

南延榮,解雁飛,薛瑞娟,張紅莉,南 剛,李 麗,李紅梅

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科一病區(qū)，陜西 延安716000)

目的 探討Caspase3在羊水過少產(chǎn)婦和羊水量正常的孕產(chǎn)婦血清中的表達(dá)差異。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測30例羊水過少和30例羊水量正常孕產(chǎn)婦外周血中Caspase3表達(dá)水平的差異。結(jié)果 Caspase3蛋白在實驗組與對照組孕產(chǎn)婦的血清中均有陽性表達(dá)。實驗組血清中的Caspase3蛋白平均濃度(124.2±16.8)比對照組高(86.7±19.4)，其表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.28,P<0.05)，同時在羊水過少組血清Caspase3與羊水量表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.45,P<0.05)。結(jié)論 羊水過少組孕產(chǎn)婦血清中Caspase3蛋白的高表達(dá)，提示Caspase3在孕產(chǎn)婦血清中的異常表達(dá)可能是羊水過少發(fā)生的原因之一。

孕產(chǎn)婦羊水過少；血清；酶聯(lián)免疫吸附法；孕產(chǎn)婦

羊水過少是妊娠期常見的妊娠合并癥之一，其定義為妊娠晚期羊水量少于300mL[1]。羊水量減少時，子宮與胎兒之間的緩沖減少，臍帶更容易受壓，同時胎肺發(fā)育受到影響，會使胎兒更容易發(fā)生胎心率異常及宮內(nèi)缺氧等危及胎兒的情況[2-3]。目前大部分羊水過少的病因不清，羊水多少不是靜止不動的，而是處于循環(huán)狀態(tài)，因此研究羊水平衡的調(diào)控有著十分重要的意義。

近年來國內(nèi)外學(xué)者開始將目光集中在參與細(xì)胞凋亡的因子在孕婦胎盤胎膜以及血清上的分布及其與羊水調(diào)節(jié)的關(guān)系。目前在婦產(chǎn)科領(lǐng)域，有關(guān)Caspase的研究多集中在妊娠期高血壓疾病及婦科腫瘤等方面，而有關(guān)與羊水過少的相關(guān)研究較少。Caspase3作為半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，參與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡的過程，是執(zhí)行人體中細(xì)胞凋亡程序的關(guān)鍵酶之一。其在妊娠婦女胎盤胎膜細(xì)胞中的正常表達(dá),確保胎盤胎膜細(xì)胞的正常凋亡,從而維持著母胎之間的物質(zhì)交換并保證胎兒的正常發(fā)育。因此本研究通過運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)一步研究Caspase3在羊水量正常組孕婦和羊水過少組孕婦中血清的表達(dá)水平的差異，探討其與羊水量異常的關(guān)系，為尋找羊水量異常的病因與發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2013年6月至2013年9月在延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科孕37～42周剖宮產(chǎn)分娩的羊水過少組產(chǎn)婦及正常組產(chǎn)婦各30例(羊水過少組初選入組為38例，剔除8例；正常組初選入組為41例，剔除11例)，兩組孕婦年齡、孕周、孕次和血清重量等均無顯著性差異，既往無內(nèi)外科合并癥及其他妊娠合并癥(妊娠期高血壓疾病、胎膜早破、胎兒宮內(nèi)生長受限、胎兒畸形及其他并發(fā)癥,近期無藥物服用史，感染及母體脫水等因素。羊水正常組剖宮產(chǎn)的指征有：前次剖宮產(chǎn)，頭盆不稱，產(chǎn)前B超檢測羊水指數(shù)(amniotic fluid index，AFI) ≤5.0cm和/或羊水最大暗區(qū)垂直深度(AFV)≤2cm，為羊水過少。剖宮產(chǎn)術(shù)中進(jìn)一步核實羊水量，羊水總量<300mL確診為羊水過少。如果術(shù)中羊水量和術(shù)前羊水指數(shù)不相符，該病例予以剔除。

1.2 血清標(biāo)本采集及ELISA方法

所有研究對象行剖宮產(chǎn)術(shù)前，常規(guī)消毒前臂，抽取5mL的靜脈血，立即將其注入已編號的未添加任何抗凝劑的潔凈試管內(nèi)，隨后在室溫下靜置50min，待其自然凝固，然后將其置入離心機(jī)中分離15min后(轉(zhuǎn)速為2 000r/min)，依次用合適的移液器將上層透亮的血清移至己標(biāo)號的潔凈聚丙烯管中，蓋緊后置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA 試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均<9%。血清中Caspase3測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，具體操作方法嚴(yán)格按照說明書操作。

具體步驟如下:

①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：a.在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第1、第2孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，然后在第1、第2孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；b.然后從第1孔、第2孔中各取100μL分別加到第3孔和第4孔，再在第3、第4孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；c.然后在第3孔和第4孔中先各取50μL棄掉，再各取50μL分別加到第5、第6孔中，再在第5、第6孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50uL，混勻；d.混勻后從第5、第6孔中各取50μL分別加到第7、第8孔中，再在第7、第8孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第7、第8孔中分別取50μL加到第9、第10孔中，再在第9第10孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第9第10孔中各取50μL棄掉。稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為120ng/L，80ng/L，40ng/L，20ng/L，10ng/L);②加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；③溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；④配液：將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用；⑤洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；⑥加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外；⑦溫育：操作同③；⑧洗滌：操作同⑤；⑨顯色：每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；⑩終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組孕產(chǎn)婦年齡、妊娠周數(shù)及妊娠次數(shù)的比較

羊水過少組孕產(chǎn)婦年齡、妊娠周數(shù)及妊娠次數(shù)與對照組比較無顯著性差異，具有可比性。

表1 兩組孕產(chǎn)婦年齡、妊娠周數(shù)及妊娠次數(shù)的比較

2.2 Caspase3在兩組血清中的表達(dá)

羊水過少組血清Caspase3平均濃度為124.2±16.8ng/mL，正常組為86.7±19.4ng/mL。兩組孕產(chǎn)婦血清中Caspase3的濃度有顯著性差異(P<0.05),見表2。

表2 Caspase3在兩組血清中的表達(dá)情況

2.3 孕婦羊水量與其血清中Caspase3濃度關(guān)系

正常組孕產(chǎn)婦羊水量與血清Caspase3關(guān)系的相關(guān)系數(shù)rs=0.14，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而在羊水過少組其值為rs=-0.45,P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示正常組孕產(chǎn)婦羊水量與血清Caspase3表達(dá)并無相關(guān)性關(guān)系，而在羊水過少組羊水量與血清Caspase3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

表3 孕婦羊水量與其血清中Caspase3濃度關(guān)系

3 討論

3.1 Caspase3的作用機(jī)制

凋亡因子Caspase家族在細(xì)胞凋亡程序中起著關(guān)鍵性作用。細(xì)胞凋亡普遍存在于自然界，對于維持人體的穩(wěn)定性和保證人體的正常發(fā)育均具有重要的意義。一旦體內(nèi)的凋亡機(jī)制發(fā)生異常將引起多種疾病的發(fā)生。Caspases在細(xì)胞內(nèi)通常以無活性的酶原形式存在。一旦無活性的酶原被激活后，活化后的Caspases能特異性的識別底物，具有高度的特異性，保證了其在細(xì)胞凋亡程序中的專一性。同時Caspases之間還能相互激活，呈級聯(lián)反應(yīng)，從而放大了其凋亡作用。

Caspase3即為半胱氨酸蛋白酶-3(天冬氨酸特異性的)。作為Caspases家族中最重要的成員之一，是細(xì)胞凋亡共同通路的效應(yīng)分子，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。正常情況下，Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑有3種。但無論哪條通途，最終都匯合于效應(yīng)Caspase ( 包括Caspase3、Caspase7)。研究者認(rèn)為，Caspase7與Caspase3具有高度同源性，在細(xì)胞凋亡途徑中作用類似。Caspase7在N端有一氨基酸殘基片段，推測其必須先在Caspase3的作用下方能被激活而引發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase3一旦被激活就啟動凋亡程序，并以級聯(lián)放大方式傳導(dǎo)和放大凋亡信號，向下游凋亡執(zhí)行因子傳遞，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。胰島素樣生長因子可調(diào)控Cyt-C釋放入胞質(zhì)，從而抑制caspase3引發(fā)的細(xì)胞凋亡[4-10]。

3.2 Caspase3與羊水過少的相關(guān)研究

妊娠是一個特別復(fù)雜的生理過程,作為組織細(xì)胞更新的一種方式，正常孕婦的胎膜細(xì)胞在胎盤胎膜發(fā)育全過程中進(jìn)行有序的細(xì)胞凋亡。Caspase3在正常妊娠胎膜絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的正常表達(dá),確保正常胎膜細(xì)胞的凋亡,維持著母胎之間的物質(zhì)交換及胎兒的正常發(fā)育。當(dāng)Caspase3的表達(dá)異常時，將誘發(fā)細(xì)胞凋亡程序發(fā)生障礙，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加后，細(xì)胞體積縮小,從而導(dǎo)致大多數(shù)滋養(yǎng)細(xì)胞表面的水通道蛋白失活，不再介導(dǎo)水分子的跨膜運(yùn)動,細(xì)胞對羊水的通透性下降，從而導(dǎo)致妊娠羊水過少的發(fā)生。因此，如果Caspase的表達(dá)異常是引起羊水過少的發(fā)病機(jī)制，那Caspase可作為一種新的治療羊水過少的手段。

本研究通過運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附方法發(fā)現(xiàn)：Caspase3蛋白在羊水過少組產(chǎn)婦血清中的濃度明顯比另一組高。本課題組[11-12]還同時采用免疫組化方法(SP法)檢測這些研究對象胎盤胎膜中Caspase3蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Caspase3蛋白在羊水過少組與羊水正常組產(chǎn)婦的胎盤胎膜中均有陽性表達(dá)，同時羊水過少組胎盤胎膜中的Caspase3的表達(dá)均比羊水正常組明顯升高。由此推測：在羊水過少組的孕婦胎盤胎膜及血清中Caspase3的表達(dá)增加可誘導(dǎo)胎盤胎膜細(xì)胞自身凋亡增加，干擾胎盤胎膜細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其功能,從而使得胎盤的血管網(wǎng)形成不良，物質(zhì)交換障礙,嚴(yán)重影響體內(nèi)的水分子及其它小分子物質(zhì)代謝及其循環(huán)，從而降低母體、胎兒及胎膜之間的水分子及其它小分子物質(zhì)交換，導(dǎo)致羊水量減少。另外，胎盤胎膜細(xì)胞凋亡增加，影響胎盤胎膜細(xì)胞上水通道蛋白(AQP)的結(jié)構(gòu)及其功能。水通道蛋白表達(dá)水平一旦下降，一方面減少母胎液體交換、胎兒血容量及胎兒皮膚腎臟水分排泄，減少羊水的生成。另一方面會改變細(xì)胞膜對羊水的通透性，阻止過多的液體重吸收進(jìn)入胎兒血循環(huán)，在一定程度上減少羊水膜內(nèi)途徑的重吸收，從而達(dá)到平衡羊水生成與吸收的目的。最后，AQP在胎盤胎膜組織中的表達(dá)減少可能參與胎盤老化及胎膜早破的病理分子機(jī)制。

3.3 展望

羊水過少的病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，Caspase3蛋白在羊水過少組孕婦的血清中的異常表達(dá)，為羊水過少的診斷及治療提供了新思路及重要參考價值,從而改善臨床結(jié)局，降低剖宮產(chǎn)率、圍生兒病率和死亡率，提高圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)質(zhì)量。但是它在羊水量的調(diào)節(jié)平衡中的確切作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，因此下一步我們期望通過制作動物模型及擴(kuò)大樣本量對羊水過少進(jìn)行多因素分析和研究，進(jìn)一步尋找羊水過少發(fā)生的生物學(xué)特性，從而揭示其發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律,最終為早預(yù)防、早診斷和早治療羊水過少提供新的方向。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：楊文方]

Expression of Caspase3 in serum of pregnant women with oligohydramnios

NAN Yan-rong, XIE Yan-fei, XUE Rui-juan, ZHANG Hong-li, NAN Gang, LI Li, LI Hong-mei

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,Yan’anUniversityAffiliatedHospital,ShaanxiYan’an716000,China)

Objective To explore the difference in Caspase3 expression in serum between pregnant women with oligohydramnios and normal pregnant women. Methods ELISA was performed to determine the concentration of Caspase3 expression in 30 cases of oligohydramnios (experimental group) and 30 normal cases (control group). Results Caspase3 in serum was positively expressed in two groups. The expression of Caspase3 was higher in the experimental group (124.2±16.8)than in the control group (86.7±19.4), and there was significant difference (t=2.28,P<0.05). At the same time the expression of Caspase3 showed a negative correlation with amniotic fluid volume in pregnant women with oligohydramnios (r=-0.45,P<0.05).Conclusion The high expression of Caspase3 in serum of pregnant women with oligohydramnios indicates that abnormal expression of Caspase3 might be one of the causes of oligohydramnios.

oligohydramnios；serum; enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)；pregnant women

2015-10-29

南延榮(1971-),女，副主任醫(yī)師，主要從事產(chǎn)科疾病的診治與研究。

李紅梅，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.020

R714

A

1673-5293(2015)02-0228-03