楊 靜，吳 剛，李園園，呂麗萍，劉 揚，龐一強

（1.包頭醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭014040；2.鄂爾多斯市衛(wèi)生學校，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000；3.包頭醫(yī)學院研究生學院，內(nèi)蒙古包頭014040；4.包頭市第四醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古包頭014030）

納米氧化鈰（CeO2）具有優(yōu)異的拋光、催化、紫外吸收和離子導(dǎo)電等特性，因而廣泛地應(yīng)用于微電路拋光、空氣凈化以及固體氧化物燃料電池等眾多領(lǐng)域［1］。隨著納米CeO2廣泛的應(yīng)用，其暴露人群和暴露量必將日趨增加。有研究顯示納米氧化鈰暴露可導(dǎo)致肺組織炎癥反應(yīng)，氣血屏障損傷，長期暴露最終導(dǎo)致肺纖維化，但具體機制尚不明確。有研究表明氧化應(yīng)激參與了肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展［2］；而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用［3］。本研究擬用不同劑量納米氧化鈰進行氣管滴注染毒，觀察各組大鼠肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性蛋白GRP78和氧化應(yīng)激指標SOD及MDA的變化，對納米氧化鈰所致肺損傷的可能機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠27只，體重220g～300g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器及試劑 納米CeO2（35nm±3nm），杭州萬景新材料有限公司產(chǎn)品（質(zhì)量分數(shù)≥99.9%）。兔抗大鼠GRP78單克隆抗體，北京博奧森公司產(chǎn)品；山羊抗兔IgG、免疫組織化學SP試劑盒、DAB顯色劑，福州邁新產(chǎn)品；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及取材 購進大鼠后先進行適應(yīng)性飼養(yǎng)，普飼，自由飲水。1周后，27只大鼠隨機分為高劑量組（400mg／kg）、低劑量組（100mg／kg）和對照組，每組9只。染毒組大鼠以30g／L戊巴比妥鈉麻醉后，采用非暴露式氣管滴注染毒（納米氧化鈰顆粒用生理鹽水配成懸浮液后高溫消毒并進行超聲分散），滴注量為2mL／kg，對照組注入等體積的生理鹽水。染毒第28天時，30g／L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，促凝管腹主動脈取血，并取部分肺葉并用100g／L中性甲醛固定，用于后續(xù)試驗。

1.2.2 血清SOD活力，MDA含量檢測 促凝管收集的血液常溫下放置3h后以3 000r／min轉(zhuǎn)速離心10min后取上層血清，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定SOD活力，硫代巴比妥酸法測定MDA［4］，具體步驟按照試劑盒說明書方法進行。

1.2.3 病理學觀察 經(jīng)100g／L甲醛溶液固定超過48h的肺組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察病理學改變，包埋好的蠟塊同時用于后期免疫組化。

1.2.4 免疫組化法檢測肺組織GRP78蛋白表達按照文獻［5］方法進行免疫組化操作組織切片，常規(guī)脫蠟、水化，加入枸櫞酸鹽緩沖液于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)，30mL／L雙氧水封閉，滴加1∶200稀釋的GRP78一抗4℃過夜，PBS沖洗3次，加入生物素標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育15min，PBS沖洗3次，DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染，10mL／L鹽酸-酒精中分化數(shù)秒，氨水反藍數(shù)秒，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.5 結(jié)果分析 由病理科醫(yī)師協(xié)助進行結(jié)果判斷：以北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供的陽性切片作為陽性對照，以0.01mol／L PBS液替代一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷：胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃（褐）色顆粒者為陽性細胞，GRP78的陽性表達指數(shù)以染色強度分數(shù)×染色細胞比例分數(shù)表示。染色強度按顏色評分：完全陰性記0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；染色細胞比例按陽性細胞百分比評分：＜5%、5%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分別評為0、1、2、3、4分。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行處理，試驗數(shù)據(jù)均以±SD表示，多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析，若方差齊，各組之間均數(shù)的比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，采用Games-Howell檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清SOD活性和MDA含量

結(jié)果見表1。由表1可見，與對照組相比，不同濃度納米CeO2顆粒染毒后大鼠血清SOD活力與MDA含量均降低。

2.2 肺組織病理學變化

肉眼觀察：對照組大鼠肺組織顏色為粉紅色，觸之較為柔軟，彈性高；染毒組大鼠肺組織顏色較暗，呈灰白色，彈性較差，部分肺組織表面可見白色結(jié)節(jié)，觸之硬，剖檢時有明顯的顆粒感，肺組織表面有明顯的結(jié)節(jié)。

光學顯微鏡觀察：對照組大鼠肺組織固有結(jié)構(gòu)完整，無破壞，肺泡腔內(nèi)未見明顯炎性細胞浸潤及纖維組織增生；肺泡隔光滑，未見增寬（圖1A）。染毒組：大量CeO2顆粒沉積，且面積較大，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，管壁嚴重充血，大部分肺組織纖維化，形成肺實變，并有異物肉芽腫形成，如圖中箭頭所示（圖1B）。

表1 不同濃度納米CeO2顆粒染毒后大鼠血清SOD活力和MDA含量Table 1 The seral levels of SOD and MDA in rats treated with different concentrations of nano CeO2

2.3 肺組織GRP78表達情況

GRP78蛋白主要位于細胞質(zhì)，鏡下染色呈棕黃（褐）色，如圖2箭頭所示。3組肺組織GRP78蛋白的陽性表達指數(shù)分別為：對照組1.40±0.84，400mg／kg染毒組6.90±1.45，100mg／kg染毒組4.00±1.15。不同劑量染毒組與對照組比較，差異顯著（P＜0.05）。

圖1 不同濃度納米CeO2顆粒作用肺組織病理變化（HE，400×）Fig.1 Pulmonary histopathologyical lesions in rats treated with different concentrations of nano CeO2（HE，400×）

圖2 免疫組化法檢測不同濃度納米CeO2顆粒作用肺組織GRP78表達（SP，400×）Fig.2 Expression of GRP78in lung of rats treated with different concentrations of nano CeO2detected by immunohistochemistry（SP，400×）

3 討論

氧化應(yīng)激［6］是指機體內(nèi)高活性物質(zhì)如ROS（reactive oxygen species）產(chǎn)生過多，超出了機體的清除能力，導(dǎo)致氧化／抗氧化失衡的一種狀態(tài)。ROS又稱反應(yīng)性氧類物質(zhì)，包括超氧陰離子（·O2-）、羥自由基（-OH·）和過氧化氫（H2O2）等，可以由細胞（如吞噬細胞、上皮細胞、中性粒細胞等）的正常代謝產(chǎn)生；也可以由外源因素誘導(dǎo)產(chǎn)生（如吸煙、輻射、粉塵等）。有研究表明［7-10］，很多納米材料如納米氧化鋅、納米二氧化鈦、納米二氧化硅、納米氧化鋁等可以通過氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致DNA受損，細胞死亡和組織損傷。而本研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鈰經(jīng)肺染毒大鼠后血清MDA和SOD無明顯改變，說明從血清學指標觀察其所致的肺損傷可能與氧化應(yīng)激的關(guān)系不大，還需進一步研究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中十分重要的細胞器，具有折疊、翻譯蛋白及維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等生理作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可由包括缺血（氧）、營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、葡萄糖等）缺乏及Ca2＋-ATP 酶抑制劑等多種因素誘導(dǎo)發(fā)生［11］。而GRP78作為ERS早期活化的標志性基因備受關(guān)注［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)通過使用非暴露式氣管滴注染毒法將35nm±3nm納米氧化鈰以不同劑量作用大鼠肺組織，不僅引起大鼠肺損傷，還使GRP78的表達水平增高，說明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了納米氧化鈰顆粒所致肺損傷。導(dǎo)致發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因可能是由于納米氧化鈰顆粒引起的物理損傷引起的［14］，納米氧化鈰顆粒作為不可生物降解的微粒屬于非法外源物進入生物體，不能被合法轉(zhuǎn)運或參與代謝。因此，它在體內(nèi)作為物理粒子與機體發(fā)生相互作用，大量的納米氧化鈰顆粒聚集堵塞微循環(huán)、導(dǎo)致肺組織缺血缺氧，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，或者破壞性穿越細胞膜及嵌入生物大分子空穴等引起生物結(jié)構(gòu)破壞，進而引發(fā)肺組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而產(chǎn)生進一步損傷和功能異常。

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